Приготовление окрашенного препарата для иммерсионной микроскопии

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксация, окраска.

 

1. Приготовление мазка.

Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Бактериологическую петлю держат в правой руке как писчее перо. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец, не прикасаясь к части пробки, которая входит внутрь пробирки.

Пробку вынимают над пламенем горелки, после чего обжигают ее края. Нужно следить за тем, чтобы пробка ни к чему не прикасалась!!

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры наносят петлей на предметное стекло. Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал. Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым, округлой формы, размером 1,5 – 2 см².

 

2. Высушивание мазка.

Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

 

3. Фиксация препарата (прикрепление к стеклу).

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними, обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу, сделать мазок более восприимчивым к окраске, т.к. мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Самым распространенным способом является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, т.к. при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание.

Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

 

4. Окраска препарата.

После охлаждения стекла производится окраска препарата. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями.

Различают простые и сложные (дифференциальные) способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры и используется только один краситель (водный фуксин Пфейффера или метиленовая синька Леффлера). Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур (методы Грама, Циля-Нильсена и др.). С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытой фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем.

После окраски мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

 

Оформление практической работы

Составить протокол самостоятельной работы по следующему плану:

1. Тема практического занятия.

2. Цель практического занятия.

3. Описание заданий самостоятельной работы.

4. Зарисовка изучаемых объектов.

5. Ответы на тестовые задания и ситуационные задачи контроля освоения заданий по самостоятельной аудиторной работе.

 

7.4. Самостоятельная работа обучающихся под руководством преподавателя.

Задание 1