Гормональный контроль концентрации белков в плазме крови.

5. Методы определения белка в сыворотке. Методы разделение белков на фракции. Диагностическое значение. Все известные способы определения концентрации общего белка подразделяют на следующие группы:

1. Азотометрические, основывающиеся на установлении количества белкового азота, для нахождения концентрации белка исходят из того, что содержание азота в белках составляет 16%, поэтому используется коэффициент 6,25. Способ неточен, так как содержание азота в различных белковых молекулах колеблется от 14 до 19%.

2. Способы, состоящие в определении плотности сыворотки — способ плавающей капли, также является неточным из-за влияния на плотность других веществ, находящихся в сыворотке.

3. Весовые (гравиметрические) — весьма трудоемки и требуют больших количеств сыворотки.

4. Рефрактометрические методы — просты в исполнении, но неточны, так как рефракция сыворотки обусловливается также минеральными веществами и углеводами.

5. Колориметрические, основанные на цветных реакциях белков:

методы, основанные на неспецифическом связывании красителя (простой абсорбции), достаточно чувствительны, но степень связывания красителя зависит от индивидуальных свойств белка (метод с кумасси бриллиантовым голубым).

биуретовый метод — наиболее широко применяется в настоящее время, основан на специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде с образованием продукта фиолетового цвета. Существуют разные модификации этого метода с целью увеличения интенсивности окраски и ее стабильности, повышения устойчивости реактива. Чувствительность и специфичность метода зависит от используемой длины волны: 540-580 нм, 263 нм или 310 нм. Метод считается самым специфичным и точным, так как присутствие ароматических аминокислот, фенолов, мочевой кислоты не влияет на биуретовую реакцию.

метод Лоури — основан на образовании вольфрамового синего и молибденового синего из фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой солей реактива Фолина-Чикольте при взаимодействии их с ароматическими аминокислотами, в основном остатками тирозина, но определенный вклад дают триптофан, гистидин, цистеин. Максимум поглощения находится в диапазоне 745-750 нм. В составе рабочего реактива имеется биуретовый реактив, что позволяет определять также пептидные связи. К недостатку метода относится отрицательное влияние на развитие окраски веществ, используемых для выделения, очистки и солюбилизации белков и отсутствие линейной зависимости интенсивности окраски от количества белка-стандарта. Метод более чувствителен по сравнению с биуретовым, но специфичность его ниже, так как интенсивность окраски зависит от аминокислотного состава белка, а также от последовательности расположения аминокислот и степени экранирования функциональных групп.

6. Нефелометрические методы.

7. Поляриметрические методы.

8. Спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени cветопоглощения в ультрафиолетовой области при двух длинах волн с дальнейшим расчетом по специальным формулам (230 и 260 нм, 280 и 260 нм, 235 и 280 нм, 215 и 225 нм, 280 и 205 нм).

Унифицированными методами определения общего белка являются:

в сыворотке крови — биуретовый метод;

в моче — полуколичественный метод Бранденберга-Робертса-Стольникова и нефелометрия (590-650 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой;

в ликворе — нефелометрия (410-480 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой и сульфатом натрия;

в жидкости серозных полостей — нефелометрия (590-650 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой.

Состав и количество фракций белков в биологических жидкостях зависит от применяемого метода фракционирования:

1. Осаждение

нейтральными солями (высаливание) - способность белков плазмы выпадать в осадок при воздействии на них растворов солей различных концентраций,

этиловым спиртом при низкой температуре;

2. Электрофоретическое фракционирование — различают несколько типов электрофореза в зависимости от поддерживающей среды. В качестве поддерживающих сред используют бумагу, ацетатцеллюлозную пленку, агаровый, полиакриламидный, крахмальный гели. При проведении электрофореза необходимо учитывать факторы, влияющие на подвижность разделяемых веществ:

заряд (обычно зависит от pH), размеры и форма молекул веществ;

электрическое поле: скорость миграции ионов прямо пропорциональна силе тока, обусловленной переносом ионов буфера и образца, напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера);

тип буфера: состав, концентрация, pH, ионная сила.

носитель: учитывается его гидрофильность, адсорбция веществ на молекулах носителя, электроосмос, диффузия.

3. Иммунологические методы — основаны на иммунных свойствах белковых фракций: иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия, радиоиммунный анализ;

4. Седиментационный анализ — основан на различной зависимости скорости оседания белков от массы и величины их молекулы;

5. Ионообменная, адсорбционная, распределительная, аффинная хроматография, гель-фильтрация.

Повышение α1- и α2-глобулиновой фракции связано с острыми и подострыми воспалительными процессами и некоторыми злокачественными опухолями, травмами, т.к. сюда входит большинство белков острой фазы (С-реактивный белок, α2-макроглобулин, α1-гликопротеид, α1-антитрипсин, церулоплазмин, гаптоглобин). Большая часть белков β-глобулиновой фракции является β‑липопротеинами, поэтому повышение этой фракции чаще всего связано с гиперлипопротеинемиями. Кроме того, влияние на динамику этой фракции оказывают трансферрин, гемопексин, компоненты системы комплемента.

Фракция γ‑глобулинов увеличивается при патологических состояниях, связанных с хроническими воспалительными процессами, т.к. содержит иммуноглобулины G, A и M.