Тема 9. Микробиологический анализ растительных объектов

Работа 9.1. Количественный учет эпифитной микрофлоры зерна.

На поверхности зерна обитают разнообразные микроорганизмы, объединяемые под общим названием «эпифитная микрофлора зерна». Большая часть эпифитных микроорганизмов составляют гнилостные бактерии рода Pseudomonas (псевдомонады); в небольшом количестве встречаются бациллы и микроскопические грибы (дрожжевые и мицелиальные). Эпифитные микроорганизмы на сухом зерне находятся в состоянии анабиоза, однако, при увеличении влажности активируются и могут вызвать порчу зерна.

Ход выполнения работы

1. Готовят МПА. Готовую среду разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.

2. Чашки Петри, колбы, пипетки заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу.

3. Водопроводную воду наливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.

4. Готовят микробную суспензию из эпифитной микрофлоры зерна. Для этого 5 г исследуемого зерна переносят в колбу с 50 мл стерильной воды. Добавляют 2-3 г стерильного кварцевого песка и перемешивают круговыми движениями в течении 5 мин. При этом получают суспензию первого разведения (кратность разведения-1:10). Затем 5мл отстоявшейся суспензии первого разведения переносят в колбу с 45мл стерильной воды, перемешивают; при этом получают суспензию второго разведения (кратность разведения - 1:100). Аналогично этому получают суспензии третьего и четвертого разведения.

5. Из каждого разведения отбирают 1мл суспензии и переносят в стерильную чашку Петри. Затем засев заливают расплавленным стерильным МПА. Засеянные чашки инкубируют при температуре 27-30⁰С в термостате 5-7 дней.

После окончания инкубационного периода подсчитывают число колоний, выросших в чашках. Количество микробных клеток соответствующей физиологической группы микроорганизмов рассчитывают по формуле:

Х= а*в, где

Х- число микробных клеток соответствующей физиологической группы в пересчете на 1 г зерна

а – число колоний, выросших в чашке

в – степень разведения микробной суспензии

 

Записи при выполнении работы

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

 

Работа 9.2. Микроскопический анализ микрофлоры силоса

 

По мере созревания силоса в силосуемой массе происходит закономерная смена микробных сообществ. На первом этапе развиваются, наряду с молочнокислыми бактериями, смешанная микрофлора, в т.ч. и гнилостные бактерии. По мере накопления молочной кислоты, деятельность смешанной микрофлоры подавляется, поэтому на следующем этапе созревание силоса в силосуемой массе преобладают молочнокислые бактерии: сна-

чала кокковые формы, а затем палочковидной формы (последние более устойчивы к кислой среде). На заключительной стадии созревания силоса кислотность силосуемой массы увеличивается настолько, что подавляется развитие и молочнокислых бактерий.

Ход выполнения работы

Из образца силоса выбирают сочный кусочек и плотно прижимают его к предметному стеклу. Полученный отпечаток сушат, готовят мазок и микроскопируют с иммерсией. На препарате обнаруживают молочнокислые бактерии родов Lactobacterium и Streptococcus, в небольшом количестве могут встречаться маслянокислые бактерии и клетки молочной плесени. Дают характеристику обнаруженным и описанным микробным клеткам.

Записи при выполнении работы

 

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

Работа 9.3. Определение общей кислотности силоса.

Молочнокислое брожение, развивающееся в силосуемом корме, приводит к накоплению молочной кислоты. Накапливающаяся кислота обеспечивает сохранность силоса, но при накоплении большого количества кислоты корм приобретает кислый вкус и плохо поедается животными. Поэтому для контроля качества проводят определение общей кислотности силоса; данный показатель измеряется процентом молочной кислоты от сырой массы силоса.

Ход выполнения работы

1. Из среднего образца силоса отбирают аналитическую пробу массой 20 г, переносят её в колбу, добавляют 200 мл воды, нагревают до кипения и кипятят 10 минут, остужают и фильтруют.

2. 10мл фильтрата переносят в стаканчик, добавляют 2-3 капли фенолфталеина и титруют 0,1Н раствором гидроксида натрия до появления розовой окраски.

3. Расчет кислотности силоса ведут по формуле

Х - содержание молочной кислоты в силосе, %;

- количество щелочи, пошедшее на титрование, мл;

- объем фильтрата, взятого для титрования, мл;

- общий объем экстракта, мл;

- масса навески силоса, г;

0,009 - количество граммов молочной кислоты, эквивалентное 1мл 0,1Н раствора гидроксида натрия;

100 - коэффициент для пересчета граммов молочной кислоты в проценты.

Записи при выполнении работы

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Контрольные вопросы

1. Что называют эпифитной микрофлорой зерна? Каков ее состав?

2. Какой метод используют для учета эпифитной микрофлоры зерна?

3. Как проводят микроскопический анализ микрофлоры силоса? Какие группы микроорганизмов обнаруживаются при микроскопировании силоса?

4. Что характеризует показатель «общая кислотность силоса»? Как определяется этот показатель?

 

Словарь терминов и определений

 

Автотрофы – микроорганизмы, способные синтезировать органические вещества из неорганических, используя энергию солнца (фототрофы) или энергию химических реакций (хемотрофы).

Азотфиксаторы – бактерии и водоросли, способные фиксировать газообразный азот из воздуха.

Аммонификация – разложение, гниение белков с образованием аммиака.

Анабиоз – состояние живых организмов, при котором происходит резкое торможение метаболизма и всех форм активности в экстремальных условиях существования.

Анаэробное дыхание – энергетический процесс окисления микроорганизмами органических веществ в анаэробных условиях, при этом окислителем служит не свободный кислород, а нитраты, нитриты и сульфаты.

Анаэробы – организмы, способные жить в среде без кислорода. Получают необходимый для жизни кислород посредством расщепления кислородосодержащих органических соединений.

Антагонизм – отрицательное взаимодействие между разными видами, расами, штаммами микроорганизмов.

Аэробное дыхание – биохимическое окисление органических веществ в присутствии и за счет молекулярного кислорода.

Аэробы – микроорганизмы, способные жить только в среде, содержащей свободный кислород.

Бактерия – микроскопический, обычно одноклеточный микроорганизм, обладающий клеточной стенкой, но не имеющий оформленного ядра.

Бактероид – бактерии, проникающие в корни (бобовых) растений, достигающие в них крупных размеров и участвующие в фиксации атмосферного азота.

Бацилла- бактерия, имеющая форму палочки.

Вибрионы – бактерии, имеющие форму коротких, изогнутых в виде запятой палочек.

Вирус – неклеточная форма жизни, представляющая собой крайне упрощенную паразитическую структуру, способную проникать в живую клетку и размножаться внутри нее.

Гетеротроф – организм, использующий в качестве источника энергии и питательных веществ материалы органического происхождения, произведенные другими видами.

Денитрификация – разрушение группой почвенных и водных бактерий солей азотной кислоты (нитратов) до нитритов, молекулярного азота и аммиака, что приводит к обеднению почвы.

Жизненный цикл особи – совокупность явлений и процессов, составляющих круговорот в течении известного промежутка времени жизни одной особи.

Инкубация – выращивание микроорганизмов при определенной температуре.

Клубеньковые бактерии – аэробные бактерии, формирующие на корнях бобовых растений клубеньки и фиксирующие азот воздуха в условиях тесного симбиоза с высшими растениями.

Косая среда (косяк) – среда застывшая при наклонном положении для получения скошенной поверхности агара.

Круговорот азота – биогеохимический процесс в биосфере, в котором участвуют организмы-редуценты, а также нитрифицирующие и клубеньковые бактерии.

Культивирование – выращивание микроорганизмов на питательных средах.

Культура – развивающиеся на питательной среде микроорганизмы.

Культура накопительная – состоит преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.

Культура чистая – содержит потомство клетки только одного вида.

Микробиология – биологическая дисциплина, изучающая систематику, морфологию, физиологию, биохимию микроорганизмов.

Микроорганизм – мельчайший, преимущественно одноклеточный организм, видимый только в микроскоп. Микроорганизмами являются: бактерии, микоплазмы, микроскопические грибы, вирусы, риккетсии, водоросли, простейшие.

Нитриты – промежуточный продукт окисления аммиака или восстановление нитратов. Присутствие нитритов указывает на существование нестойкого органического вещества преимущественно животного происхождения.

Нитрификация – процесс превращения азотсодержащих веществ в форму, пригодную для усвоения высшими растениями: аммиак – нитриты- нитраты.

Нитрифицирующие бактерии – хемосинтезирующие бактерии, окисляющие аммиак, который образуется при гниении органических остатков, до азотной кислоты, затем в ходе реакции с минеральными веществами почвы превращается в усвояемые растениями соли азотной кислоты.

Нуклеоид -бактериальное «ядро» оптически недифференциирующие частицы в полости бактериальной клетки. Содержит ДНК и несет наследственную информацию.

Пассирование (пересев) – перенесение выращенных клеток микробов из одной среды в другую (стерильную).

Посев – внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры.

Прокариоты – древнейшие организмы. Не обладают четко оформленным ядром с оболочкой и типичным хромосомным аппаратом. Наследственная информация передается и реализуется через ДНК.

Прямой агар (столбик) – плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки.

Стерилизация или обеспложивание -это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Факультативный анаэроб – способный жить как в среде без кислорода, так и в присутствии свободного кислорода.

Фиксация – обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру.

Эпифиты – организмы, живущие на поверхности надземных органов растений, но не питающиеся ими, не являющиеся их паразитами.

Эукариоты – высшие организмы, четко оформленные ядра которых обладают оболочкой, отделяющей их от цитоплазмы.