Раздел 3. Сельскохозяйственная микробиология

ТЕМА 7. Микробиологический анализ почвы.

Почва является естественной средой, наиболее плотно заселенной микроорганизмами. Поэтому деятельность почвенной микрофлоры является важным фактором, обуславливающим ее плодородие. Для характеристики микробного статуса почвы используют показатели численности почвенных микроорганизмов и активности осуществляемых ими процессов.

Работа 7.1. Количественный учет физиологических групп почвенных микробов, выделяемых по способу азотного питания.

 

В зависимости от источника азота выделяют: аминогетеротрофные микроорганизмы (питаются органическими соединениями азота - белками, пептидами, аминокислотами); аминоавтотрофные (источником азота являются минеральные соединения азота – аммонийные и нитратные формы) и о лигонитрофильные (азотфиксирующие) микроорганизмы, которые используют для питания молекулярную форму азота.

 

Ход выполнения работы.

1. Приготовление питательных сред, необходимых для выделения отдельных физиологических групп почвенной микрофлоры, отличающихся по способу азотного питания.

Среда №1. Мясопептонный агар (МПА).

Среда служит для выделения аминогетеротрофных микробов. Состав: мясной бульон, пептон, агар. Источником углерода, азота и энергетическим субстратом служат органическим соединения азота (белки, пептиды, аминокислоты). Источником минеральных элементов питания – минеральные соли, содержащиеся в мясном бульоне.

Среда №2. Среда Чапека.

Среда используется для выделения аминоавтотрофных микроорганизмов. Представляет собой водный раствор сахарозы (источник углерода и энергетический субстрат), в который добавляют минеральные соли, содержащие азот и все другие необходимые элементы минерального питания.

Среда №3. Среда Эшби.

Среда предназначена для культивирования олигонитрофильных микроорганизмов. Представляет собой водный раствор глюкозы (источник углерода и энергический субстрат) и минеральных солей, содержащих все необходимые элементы минерального питания, за исключением азота.

2. Подготовленные среды агаризируют, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.

3. Стерилизация посуды: чашки Петри, колбы, пипетки заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу.

4. Стерилизация воды: водопроводную воду наливают в колбы, закрывают ватной пробкой и стерилизуют в автоклаве в том же режиме, что и питательные среды.

5. Приготовление микробной суспензии из исследуемой почвы.

С исследуемого участка земли отбирают специальным буром несколько (3-15) проб почвы, на глубину пахотного горизонта, по диагонали участка. Отобранные пробы смешивают, тщательно перемешивают, при этом получают средний образец почвы. Из среднего образца отбирают аналитическую пробу массой 10 г, переносят в колбу с 90 мл стерильной воды. Содержимое колбы перемешивают в течение 5 минут, дают отстояться около минуты, при этом получают суспензию первого разведения, где микробы разведены по сравнению с их концентрацией в почве в 10 раз. Затем проводят второе разведение, для чего пипеткой переносят из первой колбы 10 мл суспензии первого разведения в стерильную колбу с 90 мл стерильной воды и перемешивают; в суспензии второго разведения микробы будут разведены по сравнению с их концентрацией в почве в 100 раз. Аналогично этому проводят третье, четвертое, пятое и шестое разведение. Для засева питательной среды используют суспензии пятого и шестого разведения, где концентрация микробов по сравнению с их исходной концентрацией в почве будет меньше соответственно в 100000 и в 1000000 раз.

5. Засев питательной среды.

Готовят агаровую пластику. Стерильной пипеткой отбирают 1мл микробной суспензии соответствующего разведения и переносят (соблюдая стерильность) в стерильную чашку Петри, Вращением чашки равномерно распределяют микробную суспензию и оставляют для остывания. Засеянные таким образом чашки Петри инкубируют в термостате 5-7 дней. После окончания периода инкубации подсчитывают число колоний, выросших в чашке. Количество микробных клеток соответствующей физиологической группы микроорганизмов рассчитывают по формуле:

Х= n*r, где

Х- число микробных клеток соответствующей физиологической группы в пересчете на 1 г почвы

n – число колоний, выросших в чашке

r – степень разведения микробной суспензии

 

Записи при выполнении работы.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

 

Работа 7.2. Оценка общей биологической активности почвы поскорости разложения целлюлозы.

 

Основную массу почвенной микрофлоры составляют сапрофиты, осуществляющие разложение органических остатков растений и животных. Поэтому скорость разложения органических веществ, например целлюлозы, может характеризовать микробный статус почвы, т.е. численность и активность микробов.

Ход выполнения работы

1. Готовят из исследуемого образца почвенную пластинку. Для этого в чашки Петри переносят около 20 г почвы, добавляют 10 мл воды, перемешивают и выравнивают.

2. Вырезают кружок фильтровальной бумаги, взвешивают, после чего помещают его на увлажненную поверхность почвенной пластинки и плотно прижимают к ней.

3. Чашку закрывают, помещают в термостат при Т-27-30⁰ на 2-3 недели. При этом микроорганизмы разлагают целлюлозу фильтровальной бумаги.

4. После окончания срока инкубации бумажный кружок осторожно снимают с почвенной пластинки, тщательно отмывают от почвы, высушивают и взвешивают.

Общую биологическую активность почвы оценивают по количеству разложенной целлюлозы, выраженной в процентах от исходной массы кружка фильтровальной бумаги. Расчеты ведут по формуле:

, где

Х - количество разложенной микробами целлюлозы, в % от исходной массы кружка фильтровальной бумаги;

а₁ – исходная масса кружка фильтровальной бумаги, мг;

а₂ – конечная масса кружка фильтровальной бумаги, мг.

Записи при выполнении работы.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

-----------------------------------------------------------------------------------

-----------------------------------------------------------------------------------