Тема 1. Общая характеристика техники культивирования микроорганизмов

 

Работа 1.1. Основные положения техники культивирования микроорганизмов

 

Микроорганизмы культивируют или выращивают на субстратах, содержащих необходимые микробам пищевые вещества, такой субстрат называют питательной средой. По физиологическим свойствам питательные среды могут быть универсальными, которые пригодны для культивирования многих видов микробов и э лективные, которые могут удовлетворять пищевые потребности одного какого-либо вида или одной физиологической группы микробов. К ней могут относиться микробы разного вида, рода, но они осуществляют одинаковое превращение веществ в питательной среде а, следовательно, характеризуются одинаковыми потребностями.

По физическим свойствам питательные среды могут быть жидкими и плотными. При добавлении в жидкую среду растительного полисахарида агар-агар среда становится плотной, т.е. агаризированной.

Микроорганизмы, выращенные на питательной среде, называют культурой. Микробные культуры могут быть чистыми, т.е. состоять из клеток только одного вида микробов, и накопительными, в которых преобладают клетки одного вида, (или одной физиологической группы) микробов, но содержаться микробные клетки и других видов, но в меньшем количестве.

Культивирование микроорганизмов осуществляют в стеклянной посуде (колбах, пробирках, чашках Петри). Перед постановкой культуры посуду, инструменты и среду подвергают стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием. Известно несколько методов стерилизации: 1) фламбирование или прокаливание в пламени спиртовки (металлические и стеклянные предметы - иглы, петли, предметные и покровные стекла, горлышки колб, пробирок); 2) сухим жаром (в сушильном шкафу, t 140-160⁰ С в течении 2-3 часов - стеклянную посуду); 3) насыщенным паром под давлением (в автоклаве под давление 1 атм t 120⁰ С в течении 20 минут - посуду, питательные среды); 4) кипячение (40 - минут инструменты, посуда); 5) обработка УФ лучами.

Подготовленные питательные среды засевают небольшим количеством микробного материала. Микробный материал вносят в среду с помощью специальных инструментов: микробиологической иглы или петли, пипеткой, шпателем. Посуду с засеянной средой помещают в термостат, где происходит инкубация микроорганизмов при постоянной температуре. После окончания инкубации засеянная питательная среда становится культурой.

 

 

Работа 1.2. Техника получения накопительной культуры

 

Метод используется чаще всего для выделения из исследуемой микробной среды определенной физиологической группы и изучение процессов превращения веществ, осуществляемых ими. Готовят стерильную жидкую элективную питательную среду с необходимыми микробам пищевыми веществами. Среду переносят в колбу, заражают микробным материалом, закрывают пробкой и инкубируют в термостате. В процессе инкубации происходит накопление микробных клеток выделяемой группы микробов и продуктов их жизнедеятельности. К концу инкубации среда становится культурой, состоящей из культуральной жидкости и культуры микробов, имеющей вид осадка, пленки или взвеси.

 

 

Работа 1.3. Техника выделения микробов из исследуемой среды в чистую культуру методом засева агаровой

пластинки

 

Готовят соответствующую агаризированную питательную среду. Среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве. Затем стерильные среды из пробирок переносят в стерильные чашки Петри. После остывания среды, в чашках образуется стерильная агаровая пластинка готовая к засеву.

Агаровую пластинку засевают микробной суспензией, полученной путем смешивания навески исследуемого объекта со стерильной водой. При этом микробы из суспензии распределяются равномерно по поверхности агаровой пластинки. Засеянные чашки инкубируют в термостате. К концу инкубационного периода на поверхности пластинки образуются колонии микробов. Все клетки в колонии являются потомками одной микробной клетки, которая попала на соответствующее место агаровой пластинки при ее засеве, и принадлежат к одному виду микробов.

 

 

Работа 1.4. Техника выращивания микроорганизмов в чистой культуре на плотных питательных средах

 

Выделенные в чистую культуру микроорганизмы культивируют в лаборатории для их дальнейшего исследования. Готовят агаризированную питательную среду, разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве. Затем часть пробирок оставляют в вертикальном, а часть в наклонном положении. В первом случае получают пробирки с прямым агаром (столбик), во втором – пробирки с косым агаром (косяк). Стерильной иглой (если засевают столбик) или петлей (если засевают косяк) подхватывают небольшое количество микробного материала из колонии, выросшей на поверхности агаровой пластинки в чашке (работа 1.3) и переносят в засеваемую пробирку. Пробирку с прямым агаром засевают методом укола, прокалывая иглой столбик почти до основания, а пробирку с косым агаром методом штрих, для чего на скошенной поверхности агара проводят петлей волнистую линию, не повреждая его поверхность.

Засеянные пробирки закрывают ватными пробками и инкубируют в термостате. К концу инкубационного периода в пробирках образуются колонии. Со временем (1-2 месяца) культура стареет.

При длительном хранении в лабораторных условиях могут изменяться отдельные физиолого-биохимические или морфологические особенности микроорганизмов. Чтобы избежать этого, необходимо хранить культуру чистой.

Традиционный метод хранения – пассирование (субкультивирование). Одни виды микробов требуют частых пересевов, другие можно не пересевать более месяца. В процессе такого хранения нельзя допускать пересыхания среды.

Пробирки с культурами для этого рекомендуют обертывать бумагой или пленкой и хранить в условиях, когда процессы жизнедеятельности заторможены, например, в холодильнике при 5-8 ⁰ С.

Существует ряд других способов хранения культур: под слоем стерильного вазелинового масла; в ампулах с жидким азотом; в лиофилизированном состоянии, т.е. высушенными из замороженного состояния. Спорообразующие бактерии могут храниться годами в стерильной сухой почве или соответствующей среде.

 

Контрольные вопросы

1. Что называют культивированием микробов, микробной культурой, питательной средой, универсальной и элективной средой, физиологической группой микробов, чистой и накопительной культурой, стерилизацией, засевом, инкубацией.

2. Как получают накопительную культуру? Для чего предназначена эта культура?

3. Как готовят и засевают агаровую пластинку? Какой вид имеют культуры микробов на агаровой пластинке?

4. Охарактеризуйте технику выделения микробов из среды в чистую культуру методом засева агаровой пластинки.

5. Как готовят и засевают пробирки с прямым и косым агаром? Каким образом поддерживают чистую культуру микробов длительное время? Как хранят микробные культуры?