Экспресс-методы (МФА и РНАт) для обнаружения возбудителя бруцеллеза

• Приготовление из нативного материала мазка, обработка его люминесцирующей бруцеллезной сывороткой, просмот­р. Выдача предварительного ответа не позднее 2 ч от начала исследования.
• Прогревание исследуемого материала в течение 10 мин при 100 °С. Постановка РНАт с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Выдача предварительного ответа через 2 часа, оконча­тельного - через 24 часа.
• Посев исследуемого материала на 4 чашки с питательной средой на бруцеллез (например, эритрит агар). Через 24-36 час инкубирования при 37 °С - приготовление мазков с чашек (смыв культуры физиологическим раствором). Обработка люми­несцирующей сывороткой, просмотр. Постановка РНАт со смывом, после его обеззараживания.
• Введение нативного материала в объеме 0,5 мл двум белым мышам в/бр. Хлороформирование животных через 24-40 ч, вскрытие, приготовление мазков-отпечатков из органов, обработка люминесцирующей сывороткой, просмотр. Одновременно, приготовление взвеси из органов на физиологическом растворе. После обеззараживания взвеси постановка РНАт. Через 2 часа выдача предварительного ответа, окончательного - через 24 часа. При наличии четких положитель­ных результатов выдача положительного ответа о наличии возбудителя бруцеллеза.

Приложение

Методы определения признаков диссоциации бруцелл

Проба с раствором трипафлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора трипафлавина 1:500 на фи­зиологическом растворе, в которой эмульгируют испытуемую культуру. У дис­социированных культур быстро, в течение 1-2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культуры в S-форме остает­ся гомогенной.

Реакция термоагглютинации (термопреципитации)

Смыв двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе, густотой не менее чем 2х10⁹ м.к. прогревают на водяной бане при 90 °С в течение 45 мин. Результат учитывают тотчас, после прогревания и окончательный через 24 часа - при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия бруцелл недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной.

Витальная окраска диссоциированных форм бруцелл

Уайт и Вильсон применили этот метод для дифференциации S- и R-форм коло­ний бруцелл. Метод окраски колоний кристаллическим фиолетовым основан на том, что колонии, находящиеся на разных стадиях диссоциации, окрашиваются по разному. С этой целью Альбими агар разливают в чашки Петри и подсуши­вают в течение суток, испытуемую культуру засевают, выращивают в термостате при 37 °С. Через четверо суток, когда сформируются колонии, на поверхность агара наливают водный раствор кристаллического фиолетового 1:2000. Спустя 3-5 мин краску сливают в дезинфицирующий раствор. Колонии культур просмат­ривают с помощью лупы или стереоскопического микроскопа.

Колонии, находящиеся в S-форме, имеют светло-желтый или светло-зеленый цвет, а колонии шероховатые в R-форме - темно-фиолетовый или светло-синий.

Дифференциация видов и биоваров бруцелл

Отношение первых генераций бруцелл к углекислому газу.

Первые генерации овечьих, свиных штаммов хорошо растут в обычных аэроб­ных условиях. Отдельные биовары В. abortus, В. ovis для своего первичного роста из патологического материала требуют повышенного (5-10 %) содержания углекислого газа. Этот метод может быть использован для дифференциации В. abortus и В. ovis от других видов бруцелл и справедлив только в отношении первых генераций В. abortus, так как с последующим пересевом это свойство коровьих культур утрачивается.

Бактериостатический метод

Питательный агар Альбими с фуксином 1:50000 и тионином 1:50000 раз­ливают в чашки Петри, подсушивают. Перед посевом культур каждую чашку Петри делят на сектора по количеству изучаемых культур и эталонных штаммов. Посевы эталонных штаммов трех видов первого биовара бруцелл и испытуемых культур производят стандартной петлей (диаметр 2 мм) из взвеси 2-суточной агаровой культуры на физиологическом растворе по стандарту мутности 10 ME. Одну петлю взвеси засевают штрихом или «бляшками» на сектора агара. Учет полученных результатов производят по наличию или отсутствию роста бруцелл через каждые 48 час инкубации в термостате при 37 °С в течение 6 суток.

Для приготовления сред с красками питательный агар Альбими расплавляют, охлаждают до 45-50 °С и к нему стерильно добавляют основной раствор стан­дартной краски. Приготовление красок: 0,1 г краски растворяют при растирании в ступке в 20 мл 96° этилового спирта, затем постепенно добавляют 80 мл дистиллирован­ной воды. Основные растворы (1:1000) красок могут храниться в темном месте в баночке с притертой пробкой до 6-10 месяцев.

Для получения в среде концентрации краски 1:50000 к 100 мл среды добав­ляют 2 мл основного раствора краски.

При дифференциации видов бруцелл и их биотипов применяют тионин в кон­центрации 1:50 000 и фуксин- 1:50000 (20 mg/ml).

Краски подтитровывают по эталонным штаммам бруцелл (В. melitensis 16M, В. abortus 544, В. suis 1330).

Для этого испытуемую краску добавляют в различных количествах: тионин в концентрации от 1:15000 до 1:100000, фуксин от 1:20000 до 1:100000. Концентрация красок в среде, с которыми получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл и является рабочей дозой. Среды с красками можно хранить в холодильнике 10-15 дней: для того, чтобы среды не высохли, их поме­щают в целлофановые мешки. Обесцвеченные среды применять нельзя.

Изучение сероводородообразования

На скошенную поверхность сывороточно-декстрозного агара (рН 6,8-7,2) засевают одну стандартную петлю 2 млрд./мл взвеси испы­туемой культуры. Взвесь готовят на физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности 10 ME из двухсуточной агаровой культуры.

Реактивом на сероводород служат полоски фильтровальной бумаги (1x8 см), пропитанные насыщенным водным раствором углекислого свинца. Полоски подсушивают на воздухе и хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой. После засева культуры индикаторную бумагу укрепляют между пробкой и стен­кой пробирки так, чтобы конец ее находился на уровне верхнего края среды, но не касался ее.

Для предотвращения скопления в пробирке углекислого газа, задерживающе­го образование сероводорода, в пробку вставляют П-образный патрубок. Про­бирки с посевом ставят в термостат при 37 °С.

Показателем образования сероводорода является почернение нижнего края индикаторной полоски. Интенсивность сероводородообразования определяют измерением (в мм) потемневшей части. Результаты учитывают через каждые двое суток в течение 6-и дней. При каждом учете потемневшую бумагу заменяют новой. Для окончательной оценки результатов показатели трех измерений сум­мируют.

Для В. suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода составляет примерно от 19-20 мм, для В. abortus (биовар 1) - около 5-7 мм. Штаммы В. melitensis (биовар 1), как правило, не выделяют сероводород или же вызывают легкое побурение края свинцовой бумажки. У штаммов В. neotomae показатель в среднем равен 5-8 мм. Культуры В. ovis и В. canis сероводорода не образуют.

Проба с фагом «Тb»

На подсушенный 1,5 % агар Мартена или агар Альбими в чашке Петри нано­сят 0,1 мл суспензии бруцелл в физиологическом растворе, приготовленной из 48-часовой агаровой культуры и содержащей 10 ME микробов в мл, и распреде­ляют шпателем по поверхности. На подсушенный бактериальный газон наносят бактериофаг, на одну чашку минимальную дозу РТД, на вторую максимальную - 10⁴ X РТД. Легким наклоном чашки капле бактериофага дают стечь в виде «до­рожки». После подсыхания, чашки переворачивают. Результаты учитывают через 24 ч В. abortus лизируется фагом «Тb» в дозе РТД и 10⁴ X РТД, В. me­litensis не лизируется ни одной из этих доз. В. suis может частично лизироваться фагом в концентрации 10⁴ X РТД.