Лабораторная диагностика чумы у носителей

Материал для исследования: грызуны, зайцеобразные, насекомоядные и наземные хищники, трупы мелких млекопитающих, остатки пищи из гнезд хищных птиц, материал от больных и павших верблюдов. В отдельных случаях исследуют материал от сайгаков, погадки хищных птиц, экскременты грызунов и хищников.

Животных, добытых живыми, умерщвляют прямо у капкана с помощью корнцанга. Трупы помещают в бязевые мешочки, которые плотно завязывают, снабжают этикетками, складывают в металлические отсадники, ящики или клеенчатые мешки. Кратковременное хранение материалаосуществляют в прохладном месте. Живых грызунов помещают в отсадники, металлические ящики или ящики, обитые изнутри жестью, и дустируют. Ящики должны быть снабжены решетчатой крышкой.

Полевой материал доставляют в лабораторию в предельно короткие сроки, желательно в первой половине дня. К работе с полевым материалом приступают сразу после его поступления, однакодопускается кратковременное его хранение (не более 20 ч) в помещении с низкой температурой (рефрижератор, ледник и др.).

Трупы животных после очеса погружают в 3 %-ный мыльный раствор или другое моющее средство, затем помещают на сетку, после того как раствор стечет, укладывают на вскрывочные доски, группируя по точкам добычи и видам.

При эпидемиологическом обследовании природного очага чумы тактика лабораторного подхода зависит от эпидемиологической ситуации в данном очаге:

- ситуация до обнаружения эпизоотии на данной территории;

- ситуация после выделения первой культуры возбудителя чумы.

До обнаружения эпизоотии у всех зверьков исследуют только печень и селезенку. Вскрытие проводят без отсепарирования кожи, откидывая кожно-мышечный лоскут на мордочку животного. Суспензии готовят из органов зверьков одного вида, добытых в одной точке обследования.

Для одной суспензии объединяют органы не более чем от 10 мелких зверьков, от 5 сравнительно крупных (сурки, хори и т.д.). Кусочки органов тщательно растирают в ступке со стерильным песком, затем добавляют небольшое количество 0,9 %-ного раствора хлористого натрия рН 7,2 (не более 2 мл). Полученную суспензию используют для посева на плотные питательные среды, нанося каплю суспензии у края чашки и рассевая ее по всей поверхности петлей частыми штрихами. Этой же суспензией заражают биопробное животное. После обеззараживания суспензия используется для поиска антигена.

При выделении первой культуры от животных на исследование целесообразно забирать кроме печени и селезенки еще кровь и проводить дублирование посевов –отпечатками органов и посевами суспензий. При посеве отпечатками на одну чашку агара может быть посеян материал от 2 животных.

При обнаружении характерных для чумы патологоанатомических изменений у животных, кроме печени, селезенки, крови, обязательно исследуют легкие, лимфоузлы (паховые, аксилярные, глоточные, паратрахеальные, забрюшинные) и участки измененных органов и тканей. Из всех органов делают мазки-отпечатки и исследуют их. Органы от каждого животного сеют отпечатками на пластинки агара, затем собирают в ступку со стерильным песком и готовят суспензию, которую засевают на агар. Этой же суспензией заражают индивидуальную биопробу. Остальной материал после обеззараживания используют для серологического исследования, направленного на поиск специфических для чумы антигенов (РПГА-РНАт), а также для выявления ДНК возбудителя чумы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суспензии сгустков крови сердца и крупных сосудов после инактивации исследуют серологически на наличие специфических антител (РПГА-РНАг).

Трупы животных,найденных в поле, исследуют так же, как зверьков с патологоанатомическими изменениями, но, кроме этого, уних обязательно исследуют костный или головной мозг (посевом на отдельную чашку и постановкой индивидуальной биопробы). Для посевов используют селективные питательные среды с ингибиторами роста посторонней флоры.

При исследовании полевого материала в качестве биопробных животных могут быть использованы белые мыши и морские свинки. Заражают биопробных животных подкожно в паховую область. В случае работы с сильно загрязненным материалом (загнившие трупы, субстраты нор, помет) применяют накожный метод заражения.

Павших биопробных животных исследуют, проводя вскрытие по полной схеме (отсепаровка кожи, осмотр и посев лимфоузлов, посев всех органов, крови, серологическое исследование на наличие антигена). От павшей биопробы обязательно ставят пассажи до выяснения причины гибели. После обеззараживания суспензия органов павшей биопробы может быть исследована в ПЦР.

Биопробных животных, выживших после заражения, забивают через 6 суток также с полным бактериологическим исследованием без пассажа. При исследовании материала из сочетанных природных очагов чумы и туляремии биопробных животных забивают на 8-9-е сутки.

Чашки с посевами инкубируют при 28 °С. Просмотр осуществляют через 24-48 ч и далее ежедневно до 5 суток от момента посева.

Выделенную культуру идентифицируют по следующим признакам:

• морфология роста на питательном агаре и бульоне;

• морфология клетки, характер окраски по Граму;

• лизис диагностическими бактериофагами Л-413С, Покровской;

• ферментация мочевины, рамнозы, глицерина;

• характерный рост на среде ЦДС (отсутствие способности к ферментации мочевины и лактозы);

• чувствительность к антибиотикам дискодиффузионным методом (при выделении первой культуры).

Окончательную идентификацию и изучение культуры чумного микроба проводят в стационарной лаборатории противочумной станции или института, имеющей разрешение на проведение экспериментальной работы с микроорганизмами I группы патогенности по следующим признакам:

• наличие F1;

• биохимическая активность (пестрый ряд), подвижность;

• вирулентность для лабораторных животных;

• плазмидный состав (pCad, pPst, pFra);

• способность к нитрификации и денитрификации;

• пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазная активность;

• чувствительность к пестицину 1;

• питательная потребность (при необходимости).

Серологический метод исследования полевого материала. Все серологические исследования ведутся только с обеззараженным материалом и оттитрованными (не реже 1 раза в 2 недели) ингредиентами. Формалин используют нейтральной рН и с проверенной антибактериальной активностью.

Для поиска антител исследуют сыворотки, смывы из сердца и крупных сосудов или высушенные на фильтровальных бумажках образцы крови и сыворотки животных. Поиск антител осуществляют у зверьков, относительно резистентных к чумному микробу (малый, длиннохвостый, горный, даурский суслики, полуденная песчанка с левого берега Волги, даурская пищуха, мелкие куньи и др.). Для обнаружения антител используют РПГА с антигенным диагностикумом, а также РНАг с иммуноглобулиновым диагностикумом. При массовых исследованиях реакции ставят в два этапа: вначале каждая из реакций в двух лунках и только при положительных результатах ставят развернутые реакции для определения их титра. Система однонаправленных реакций весьма информативна, т. к. по соотношению титров двух реакций (превышение титра РНАг) можно судить о давности контакта зверька с микробом, а при достаточно большом количестве исследований – о фазе эпизоотии на данном участке территории.

При сомнительных результатах реакции повторяют после адсорбции исследуемого материала 50 %-ной взвесью формалинизированных и несенсибилизированных эритроцитов, параллельно ставят идентичные реакции с гетерологичными диагностикумами (туляремийным, бруцеллезным, холерным и др.).

Для поиска антигена готовят суспензии из исследуемого материала (приложение) и ставят серологические реакции: РПГА и РТПГА с иммуноглобулиновым диагностикумом и РНАт с антигенным диагностикумом.

С целью подтверждения специфичности результатов следует тот же материал использовать в системе серологических реакций (РПГА-РНАт) с гетерологичными диагностикумами (туляремийным, бруцеллезным, холерным и др.).

Тактика применения иммуноферментного анализа для поиска антигена FI и антител к нему такая же, как при использовании иммуносуспензионных методов.

ПЦР используется при углубленном эпизоотологическом обследовании территории (преимущественно в пунктах долговременного наблюдения). Исследованию подлежат суспензии органов носителей чумы с характерными патологоанатомическими изменениями, трупов павших зверьков, трупов верблюдов, а также, при необходимости, суспензии эктопаразитов, субстраты гнезд грызунов, погадки и остатки пищи хищных птиц, пробы почвы и др. Для проведения генодиагностического анализа применяют «Тест-систему для выявления Y. pestis методом полимеразной цепной реакции», производства РосНИПЧИ «Микроб» (рекомендована комитетом МИБП МЗ РФ для практического использования).

Метод ДНК-зондов может быть использован как для характеристики плазмидного профиля штаммов при идентификации выделенных культур, так и при исследовании суспензии органов животного. Для повышения чувствительности метода возможно подращивание образцов путем помещения нейлонового фильтра с нанесенным материалом на поверхность агара Хоттингера на 16-24 ч при 28 °С. После нанесения исследуемого материала на фильтр его инактивируют парами хлороформа. Для этого на крышку чашки Петри, в которую помещен фильтр с исследуемым материалом, наносят 0,5 мл хлороформа, выдерживают в таком виде (крышка снизу) в эксикаторе в течение 30 мин, после чего фильтр считается обеззараженным и может пересылаться для дальнейшего исследования в стационарную лабораторию противочумной станции или института.