Внимание: соблюдать меры безопасности при работе с источником ультрафиолетового излучения, концентрированной серной кислотой и нагреванием на спиртовке.

ХОД РАБОТЫ: В две пробирки добавляют по 1 капле воды (избыток воды мешает реакции) и растворяют: в 1-ой несколько кристаллов цитрата, а во 2-ой - янтарной кислоты. Затем в обе пробирки вносят по 10-12 капель конц. серной кислоты и несколько кристаллов резорцина. Содержимое пробирок осторожно нагревают (но НЕ КИПЯТЯТ!) до появления окраски желтого цвета. К охлажденным пробиркам добавляют по 20 капли дистиллированной воды и наблюдают в ультрафиолетовом свете флюоресценцию: голубую в пробирке с цитратом и зеленую - с сукцинатом.

ВЫВОД:

 

 

Лаборатоpная работа № 2. Качественное обнаружение цитохромоксидазы.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Цитохромоксидаза, содержащаяся в скелетной мышце, обесцвечивает 2,6- дихлорфенолиндофенол (краску Тильманса), переводя его в восстановленную форму.

ХОД РАБОТЫ: 1 г свежих скелетных мышц, освобожденных от жировой ткани, тщательно растирают в ступке в течение 10 минут. Мышечную кашицу фильтруют через слой марли и многократно промывают твердый осадок дист. водой до обесцвечивания промывных вод.

На мышечную кашицу, отжатую между листами фильтровальной бумаги, капают 2-3 капли раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и наблюдают его обесцвечивание, связанное с активностью цитохромоксидазы мышечной ткани (восстановление краски Тильманса в лейкоформу):

 

ВЫВОД:

 

ЗАНЯТИЕ 6.

Тема: Биологическое окисление 2. Пути потребления кислорода в организме. Тканевое дыхание. Окислительное фосфорилирование. Микросомальное и перекисное окисление.

 

Цель занятия: Сформулировать современные представления о механизмах получения, депонирования и утилизации энергии в живых организмах, путях потребления кислорода в организме в норме и при патологии.

Исходный уровень знаний и умений:

Студент должен знать

1. Понятие об электродвижущая силе окислительно-восстановительных реакций.

2. Строение NAD⁺, NADP⁺, FAD, FMN, кофермента Q и цитохромов и их роль в окислительно-восстановительных процессах.

3. Электронное строение атома кислорода и его активных форм; каталаза, пероксидаза.

4. Сущность свободно-радикальных процессов.

Студент должен уметь:

1. Проводить титрационный анализ

Структура занятия:

1. Теоретическая часть:

1.1. Пути утилизации кислорода в организме (митохондриальное, микросомальное и перекисное окисление)

1.2. Структура и функция дыхательной цепь (ДЦ) митохондрий. Комплексы ДЦ. Основные принципы и механизм функционирования ДЦ митохондрий. Ферменты тканевого дыхания: NAD⁺, NADP⁺, FAD - зависимые дегидрогеназы, убихинон, цитохромы, их строение и роль.

1.3. Окислительное фосфорилирование (ОФ). Пункты фосфорилирования. Коэффициент P/О показатель степени сопряжения ОФ. Механизмы сопряжения окисления и фосфорилирования. Хемиосмотическая теория сопряжения окислительного фосфорилирования П. Митчелла. Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители. Механизм действия разобщителей. Биологическое значение разобщения ОФ.

1.4. Значение тканевого дыхания в биоэнергетике клетки и организма. Энергетический баланс одного оборота ЦТК.

1.5. Микросомальное окисление. Понятие о микросомах. Характеристика ЭПС. Микросомальная ДЦ. Основные переносчики: NAD⁺, NADP⁺, FAD и FMN - зависимые дегидрогеназы, цитохромы b₅, P₄₅₀, их функции. Субстраты и косубстраты микросомального окисления (метаболизм ксенобиотиков).

1.6. Сходство и отличие микросомальной и митохондриальной ДЦ. Связь ЦТК, ДЦ митохондрии с микросомальной ДЦ. Биологическое значение и органное распределение микросомального окисления.

1.7. Понятие о перекисных процессах. Электронное строение атома кислорода. Механизмы образования активных форм кислорода. Перекисное окисление в норме и при патологии. Антиоксидантная защита: ферментная (СОД, каталаза, пероксидаза и др.) и неферментная (глутатион, витамины А, С, Е, метаболиты, и др.).

1.8. Витамины А, С, Е их строение и роль в обмене.

2. Практическая часть выполнение лабораторной работы:

2.1. Количественное определение активности каталазы крови (по Баху и Зубковой).

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

 

Литература основная:

1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 213-220, М., Медицина, 1998, стр. 305-317.

3. Николаев А. Я. Биохимия, М., Высшая школа, 1989, стр. 199-231.

дополнительная

4. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии М., Высшая школа, 1993, стр. 403-438.

5. Р. Марри и др. Биохимия человека, М., Мир, 1993, том 1, стр. 111-139.

6. Ленинджер А. Основы биохимии, М., Мир, 1985, том 2, стр. 403-438, 508-550.

7. Албертс Б. и др., Молекулярная биология клетки, М., Мир, 1994, том 1, стр. 430-459.

8. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М., Наука, 1989.

ЗАДАЧИ:

1. При прохождении электронов от сукцината через ДЦ к кислороду верными условиями являются:

а) отношение P/O = 2.	г) участвует NADH-дегидрогеназа.
б) участвует коэнзим Q.	д) отношение P/O = 1
в) участвует цитохром Р450.

 

2. Что не принимает участия в транспорте электронов по митохондриальной ДЦ?

а) NADH	в) негемовое железо	д) флавопротеид
б) цитохром P450	г) цитохром b	е) цитохром b5

 

3. При окислении 1 грамма какого из субстратов выделяется больше АТФ?

а) изоцитрата	в) олеиновой кислота	д) гликогена
б) аспартата	г) фруктозы	е) сукцината

 

4. При окислительном фосфорилировании динитрофенол является:

а) ингибитором NAD⁺ - потребляемых реакций.

б) ингибитором цитохромов.

в) ингибитором синтеза АТФ и дыхания.

г) разобщителем

д) ингибитором SH-групп

е) переносчиком протонов (протонофором)

 

5. Какие из указанных фосфатных соединений имеют более отрицательное значение DG°при гидролизе, чем ГТФ?

а) Г-1-Ф.	в) 2,3-дифосфоглицерат.	д) глицерол-1-фосфат.
б) Г-6-Ф.	г) фосфоенолпируват.

 

6. Цитохромоксидаза содержит:

а) кобальт	в) магний	д) медь
б) цинк	г) ванадий.	е) селен

 

7. Цитохромоксидаза специфически ингибируется:

а) CO2	г) цианидами
б) реагентом Шиффа	д) H2S
в) парахлормеркурийбензоатом (-SH реагент)	е) СО

 

8. Фосфорилирование АДФ в АТФ возможно за счет субстратов:

а) 3-ФГА	г) фосфоенолпирувата
б) 1,3-диФГК	д) ацетил-КоА
в) фруктозо-1,6-дифосфата	е) сукцинил-КоА

 

9. Какие ферменты могут фосфорилировать АДФ?

а) цитратсинтетаза	в) фумараза	д) протонная АТФ-аза
б) СДГ	г) a-кг-ДГ	е) сукцинилтиокиназа

Практическая часть:

Лабораторная работа № 1: Количественное определение каталазы по Баху и Зубковой.

 

ПРИНЦИП МЕТОДА: основан на титриметрическом определении количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ ¾® 2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества KMnO₄, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается в 1 мкл крови.

ХОД РАБОТЫ: разведенную кровь (1: 1000) взбалтывают и добавляют по 1 мл в две колбы, приливают по 7 мл дистиллированной воды; в опытную пробу добавляют 2 мл 1% раствора H₂O₂, а в контрольную - 5 мл 10% раствора H₂SO₄. Действие каталазы в кислой среде (в контрольной пробе) прекращается, т. к. оптимум pH = 7,4.

Колбы оставляют при комнатной температуре на 30 минут. Затем приливают в опытную колбу 5 мл 10% H₂SO₄, а в контрольную - 2 мл 1% H₂O₂. Содержимое каждой колбы титруют 0,1н раствором KMnO₄ до появления бледно-розовой окраски.

Рассчитывают каталазное число (КЧ) по формуле:

КЧ = (А - В)´1,7

где:

А - количество мл 0,1н раствора KMnO₄, пошедшее на титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена,

В - количество мл 0,1н раствора KMnO₄, пошедшее на титрование опытной пробы, мл;

На титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора KMnO₄, чем на титрование опытной пробы. Полученную разность умножают на 1,7 (коэффициент пересчета) и получают каталазное число для исследуемой крови.

В норме каталазное число составляет 10 - 15 единиц.

 

Клинико-диагностическое значение

Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях активность каталазы в крови снижается.

ПРИМЕЧАНИЕ: Показателем каталазы служит дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

 

ЗАНЯТИЕ 7.

ТЕМА: Контрольное занятие по разделам I и II “Энзимология и биологическое окисление”.

Цель занятия: контроль усвоения вопросов пройденных тем "Химия белков", "Энзимология" "Биологическое окисление"

Контрольные вопросы:

1. Краткая история биохимии. Значение биохимии для врача.

2. Характеристика основных биохимических методов.

3. Общая характеристика обмена веществ. Понятие об анаболизме, катаболизме и метаболизме.

4. Строение, свойства и классификация аминокислот. Значение аминокислот.

5. Уровни структурной организации белковой молекулы. Определение структурной связи, удерживающей структуры.

6. Форма и размер белковой молекулы. Молекулярная масса белков.

7. Физико-химические свойства белков. Функции белков.

8. Качественные реакции на белки и аминокислоты.

9. Высаливание, денатурация белков (механизм, признаки). Использование денатурации в лечебной и лабораторной практике.

10. Доказательства белковой природы фермента. Выделение и очистка ферментов.

11. История энзимологии. Понятие о ферментах. Особенности ферментативного действия.

12. Строение ферментов. Кофакторы ферментов: ионы металлов и коферменты (участие витаминов в построении коферментов). Активный центр фермента (каталитический, субстратный, аллостерический участки).

13.Механизм действия ферментов. Теория промежуточных соединений. Энергия активации. Энергетический барьер.

14. Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, рН, температура, лекарственные препараты).

15. Выделение и очистка ферментов, качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов.

16. Номенклатура и классификация ферментов.

17. Локализация ферментов в клетке. Органоспецифические и маркерные ферменты. Изменения ферментативного спектра в онтогенезе.

18. Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, ионов активаторов, ингибиторов. Виды ингибирования.

19. Аллостерические ферменты. Определение, структура, свойства и кинетика ферментов. Механизм регуляции. Биологическое значение.

20. Изоферменты, их биологическая роль и происхождение. Использование изоферментов в диагностике.

21. Предмет и задачи медицинской энзимологии.

22. Энзимопатии, их классификация, причины возникновения.

23. Механизм развития метаболических разрушений. Степень клинических проявлений энзимопатий.

24. Характеристика основных ферментов плазмы. Типы изменения активности ферментов в крови.

25. Энзимодиагностика. Задачи и объекты исследования.

26. Энзимотерапия (иммобилизованные ферменты, липосомы).

27. Применение ферментов в лабораторной диагностике.

28. Количественное определение каталазы (принцип метода, диагностическое значение).

29. Определение амилазы (диастазы) мочи по Вольгемуту (принцип метода, диагностическое значение).

30. История учения о биологическом окислении. Взгляды М.В.Ломоносова, А.Лавуазье, Ф.Шенбайна, А.Н.Баха, В.И.Палладина.

31. Современные представления о биологическом окислении. Принципы преобразования и передачи энергии в клетке. Окислительно-восстановительные реакции, окислительно-восстановительный потенциал.

32. Основная роль биологического окисления. Схемы образования субстратов из белков, липидов и углеводов.

33. Этапы биологического окисления (ЖКТ, цитоплазматический и митохондриальный).

34.Строение АТФ, значение. Высокоэнергетические фосфаты. Природа макроэргичности. Субстратное фосфорилирование. Биологическое значение.

35. Строение и функции митохондрий. Сравнительная характеристика мембран митохондрий. Локализация митохондриальных ферментов.

36. ЦТК - как общий конечный путь использования субстратов биологического окисления. Последовательность реакций, ферменты, коферменты.

37. Значение ЦТК. Регуляция ЦТК.

38. Ферменты тканевого дыхания (НАД; ФАД-зависимые дегидрогеназы, убихинон; цитохромы, их строение, роль).

39. Витамин PP. Строение, роль в энергетическом обмене.

40. Витамин B2. Строение и роль в энергетическом обмене.

41. Дыхательная цепь. Перенос электронов в ней. Основные принципы функционирования дыхательной цепи. Комплексы ДЦ.

42. Механизмы сопряжения окислительного фосфорилирования. Строение и функции протонной АТФ-азы. Коэффициент Р/О.

43. Хемиосмотическая теория Митчелла. Механизм генерации протонного потенциала. DmН+ его структура и пути утилизации.

44. Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители окислительного фосфорилирования, их природа и механизм действия.

45. Особенности митохондриального окисления в бурой жировой ткани, ее биологическая роль.

46. Значение митохондриального окисления в биоэнергетике клетки и организма.

47. Микросомальная цепь переноса электронов. Механизм окисления.

48. Значение микросомального окисления в биоэнергетике клетки и организма.

49. Сходство и отличие микросомального и митохондриального окисления.

50. Образование активных форм кислорода, их биологическая роль.

51. Антиоксидантная защита, СОД, каталаза, пероксидаза, их биологическая роль. Антиоксиданты.

52. Витамин С. Химическая природа, роль в обмене веществ.

 

РАЗДЕЛ III.

БИОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ

ЗАНЯТИЕ 8.

ТЕМА: Углеводы 1. Химия углеводов. Переваривание и всасывание. Метаболизм гликогена.

 

Цель занятия: Сформировать представления о биологической роли, молекулярных механизмах переваривания и всасывания углеводов, путях метаболизма углеводов в живых организмах.