Специфичные лиганды, используемые в аффинной хроматографии

 

Лиганд	Отделяемый продукт
Субстрат Кофактор (кофермент) Ингибитор Рецептор Гепарин Антитела Гепарин	Фермент Фермент (апофермент) Фермент Гормон Фактор коагуляции крови Антигены Антитело

 

Таблица 13

Групповые лиганды, широко используемые в различных вариантах аффинной хроматографии

Лиганд	Определяемый продукт
Алкильная или арильная группировка Функциональные группы органических красителей Агенты хелирующие металлы Активированные SH-группы	Различные белки   То же   То же Белки с SH-группами

 

При этом одни и те же вещества могут выступать и в роли лигандов и в роли определяемых продуктов.

Различают несколько вариантов аффинной хроматографии:

1.Аффинная хроматография или аффинная адсорбция на геле (достаточно широко используется);

2.Аффинная преципитация – внедряется;

3.Аффинное разделение – внедряется.

 

1.Аффинная хроматография или аффинная адсорбция на геле (достаточно широко используется)

Данная разновидность аффинной хроматографии в настоящее время используется наиболее широко. Так, например, при выделении ферментов, сорбентом служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. При пропускании через колонку извлечения фермент взаимодействует с содержащимся субстратом, что приводит к его удерживанию. После насыщения колонки фермент элюируют с нее подходящим растворителем. Разделение по методу афинной хроматографии может быть основано на других специфических взаимодействиях: фермента с ингибитором, гормона с рецептором и т.д.

2. Аффинная преципитация

В данном случае лиганды прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении к данной системе смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после введения раствора электролита. Осадок отделяется и при необходимости из комплекса выделяется чистое вещество.

3.Аффинное разделение

Основано на использовании двух водорастворимых полимеров. Один полимер (например, полиэтиленгликоль) несет специфические лиганды, другой полимер обладает сродством к остальным, примесным компонентам. Так например, необходимо отделить ферменты от смеси белков, нуклеиновых кислот, фрагментов клеточных структур. Для этого используют смесь полиэтиленгликоля, несущую молекулы лиганда (субстрат, кофактор, ингибитор) и полярный декстран:

Ф, Б, НК + ПЭГ (Л) + ПД = ПД•Б•НК + ПЭГ (Л)•Ф

Где:

ПЭГ (Л) - полиэтиленгликоль, несущий молекулы лиганда (субстрат, кофактор, ингибитор);

Ф, Б, НК – ферменты, белки, нуклеиновые кислоты;

ПД - полярный декстран (растворимый);

Дальнейшее разделение на основании различной растворимости образованных комплексов.

Аффинное разделение является самым эффективным способом аффинной очистки.

ТП – 6. Стандартизация

Стандартизация максимально очищенных органопрепаратов для парентерального применения проводится по тем же показателям, что и других химических соединений. Особенностью является то, что очень часто применяются биологические методы стандартизации, основанные на специфическом действии соединений. Например: препараты инсулина стандартизуют по способности снижать содержание сахара у кроликов; препараты питуитрина – по способности вызывать сокращение изолированного рога матки морской свинки.

 

УМО – 7. Фасовка, упаковка, маркировка

Является предварительной стадией, т.к. ввиду нестойкости соединений сразу идет передача готового, стандартного продукта на изготовление лекарственных форм.

Получение лекарственных форм

Получение лекарственных форм на основе максимально очищенных препаратов это отдельный технологический процесс. Технологическая схема данного процесса зависит от вида лекарственной формы (раствор или суспензия), но, как правило, кроме стадий вспомогательных работ в технологической схеме имеются следующие основные стадии технологического процесса:

ТП – 2.1 Растворение (суспендирование)

При проведении данной стадии очищенная сумма веществ или выделенное вещество растворяют (или суспендируют) в необходимом растворителе. При необходимости доводят до определенного значения РН и добавляют консерванты (фенол 0,25-0,3%, глицерин, нипагин).

ТП – 2.2 Стерилизация

Большинство гормонов и ферментов являются термолабильными веществами, поэтому для их стерилизации применяют стерильное фильтрование (см. тему «Инъекционные растворы») и в дальнейшем простерилизованный раствор высушивают лиофильно.

Общие сведения о максимально-очищенных органопрепаратах

Наибольшее (распространение) значение среди максимально очищенных органопрепаратов имеют препараты гормонов щитовидной железы, задней и передней доли гипофиза, железы.

Инсулины

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен. Инсулин представляет собой небольшой глобулярный белок содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей (цепь А - 21 остаток, цепь В -30 остатков), которые связаны дисульфидными мостиками.

Выпускаемые в настоящее время препараты инсулина классифицируются:

I. По видовой принадлежности (по источнику получения)

Согласно данной классификации инсулины подразделяются на две группы:

1. Инсулин, получаемый из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней (бычий, быче-свиной, свиной)

2. Инсулин человеческий (обозначение – НМ)

Производство инсулина на основе поджелудочной железы крупнорогатого скота осуществляется крайне редко, т.к. говяжий инсулин отличается от инсулина человека на три аминокислоты, что влечет при введении в организм человека интенсивную выработку антител к чужеродному белковому соединению. Для производства животного инсулина чаще используют поджелудочную железу свиньи. В молекуле свиного инсулина в тридцатом положении цепи В содержится аланин, а в человеческом – трионин, поэтому свиной (суинсулин, актрапид) менее иммуногенный. В 1980 году фармацевтическая компания «Ново индастри» (Дания) разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30 –го остатка аланина в цепи В на остаток треонина.

В настоящее время человеческий инсулин получают двумя методами:

1. Из свиного инсулина путем соответствующих ферментативных превращений.

2. Методом генной инженерии путем получения штамма кишечной палочки или дрожжей активно вырабатывающих инсулин.

II. По длительности действия.

Согласно данной классификации инсулины подразделяются на три группы:

1.Инсулины короткого действия (длительность действия 6-8ч.)

Представители: суинсулин, актрапид.

2. Инсулины средней продолжительности действия (длительность действия 10-12ч., иногда до 18ч.). Данная группа инсулинов, как правило, представляет собой аморфные суспензии инсулина.

Представители: Семилонг - инсулин, инсулин - семилетте, протамин-цинк-инсулин для инъекций, суспензия цинк-инсулина аморфного, суспензия инсулин - протамина для инъекций

3. Инсулин длительного действия (длительность действия свыше 24 часов)

Представители: суспензия Zn-инсулина кристаллического для инъекций (инсулин-ультралонг), суспензия Zn-инсулина для инъекций (инсулин - лонг)

Инсулины длительного действия представляют собой микрокристаллические суспензии или смесь микрокристаллических и аморфных суспенций.

III. По степени очистки

По степени очистки препараты инсулина подразделяются:

1.Традиционные препараты инсулина

2. Высокоочищенные препараты инсулина

Антигенные свойства животного инсулина определяются не только отличительными аминокислотами, но и примесями в препарате (проинсулина, инсулиноподобных белков, белков большей молекулярной массы). При использовании традиционных способов очистки полностью освободиться от этих примесей не удается.

Современные методы очистки позволяют получить высокоочищенные препараты свиного инсулина. Примеси инсулиноподобных белков, белков с молекулярной массой 15000 и белков с молекулярной массой от 9000 до 12000 можно удалить в результате дополнительной очистки животного инсулина методом гель-хроматографии с выделением «пика» инсулина.

Монопиковый инсулин содержит незначительное количество проинсулина и инсулиноподобных белков. Лекарственные препараты монопикового инсулина отучественного производства обозначаются «МП», импортного производства «МР». Например: «СМП» - свиной монопиковый инсулин (очистка гелевой хроматографией – Химулин-М).

Монокомпонентные препараты инсулина вообще не содержат примесей белковых соединений, при их получении для выделения инсулина используюют аффинную хроматографию, в которой в качестве лиганда используют монокланальные антитела к инсулину свиньи. Перед этим предварительно инсулин очищают методом ионообменной хроматографии. Препараты высокоочищенного свиного инсулина промышленного производства выпускаются с 1973 года и обозначают «МС» или «МСК» – монокомпонентный (очистка ионообменной хроматографией). При применении монокомпонентных препаратов инсулина многие побочные эффекты устраняются.

Например: Монотард-МС

Актропид-МС