Екстрагування ферментів з поверхневих культур

Всі ферменти є водорозчинними білками, тому найкращим екстрагентом для них є вода. Для видалення ферментів з дріжджових та бактеріальних клітин їх необхідно зруйнувати використовуючи механічні, хімічні або біологічні методи, оскільки їхні клітинні стінки мають високий дифузійний опір. Оболонки міцеліальних клітин мають низький дифузійний опір, тому дезінтеграція клітин грибів непотрібна.

На повноту екстрагування ферментів впливають багато факторів: температура, рН, тривалість процесу, конструктивні особливості екстракційних апаратів.

Серед небажаних процесів, що можуть відбуватися після дезінтеграції клітин, – протеоліз власними клітинними протеазами цільового ферменту. Цей процес може відбуватися навіть при підтриманні низької температури, особливо при очищенні ферменту, оскільки після видалення супутніх білків фермент стає єдиним субстратом протеази. Інактивацію протеаз здійснюють обробкою клітинного екстракту специфічними інгібіторами-комплексонами (ЕДТА, о-фенантролін, оксихінолін), солями ртуті або срібла. Протеази можуть бути видалені також сорбцією на афінних сорбентах. Якщо протеази термолабільні, а цільовий фермент термостабільний, їх можна денатурувати нагріванням клітинних екстрактів.

Денатурацію нуклеїнових кислот в процесі очищення ферментів обумовлює низька іонна сила чи основність середовища. Можна використати спеціальні осадники, що утворюють з нуклеїновими кислотами нерозчинні комплекси. З цією метою використовують бромістий цетилтриметиламмоній, стрептоміцин сульфат, протаміносульфат, поліетиленімін. Інший метод видалення нуклеїнових кислот використання нуклеаз – панкреатичних ДНК-аз та РНК-аз.

Осадження ферментів

Переважна більшість промислово важливих ферментів є водорозчинними білками. Розчини ферментів можуть бути різного походження: екстракти з поверхневих культур мікроорганізмів, фільтрати з гомогенатів рослинних і тваринних тканин, лізати мікроорганізмів, фільтрат культуральної рідини, яку отримують при глибинному вирощуванні мікроорганізмів. Ці розчини ферментів неоднорідні і є складними системами, що містять крім ферментів велику кількість розчинних у воді сполук. Виділення ферментів з цієї складної суміші є непростим завданням, оскільки система дуже чутлива до зовнішніх впливів і тому забезпечення високого виходу ферменту в осад вимагає чіткого дотримання умов, при яких починається агрегування білкових молекул і випадіння їх в осад.

Розчинність білка визначається розподілом гідрофобних і гідрофільних залишків на поверхні молекули. Змінюючи деякі властивості білкових розчинів (температуру, іонну силу, рН, додавання нейтральних солей, водорозчинних органічних сполук або інших інертних речовин), можна вплинути на гідратний або сольватний шар і викликати агрегацію білкових молекул і випадання їх в осад.

Осадження ферментів органічними розчинниками. Ефект осадження білків пов'язаний з тим, що в присутності органічного розчинника знижується активність води. Зі збільшенням концентрації розчинника знижується здатність води до сольватації заряджених гідрофільних молекул ферменту. Діелектрична постійна розчинника знижується, відбувається витіснення молекул води з поверхні білкової молекули та їх часткова імобілізація молекулою органічного розчинника внаслідок гідратації білка. Тому молекули води, розміщені на гідрофобних ділянках поверхні білка, можуть бути заміщені на молекули органічного розчинника. При цьому розчинність білків знижується, відбувається агрегування і осадження білкових молекул.

Агрегування білків відбувається під дією електростатичних і Ван-дер-Ваальсових сил, що виникають між окремими білковими молекулами. Гідрофобна взаємодія, ймовірно, має менше значення в результаті впливу органічних розчинників на неполярні ділянки білкової глобули.

Органічний розчинник, який використовують для осадження, повинен повністю змішуватися з водою і не зв'язуватися з ферментом. Найбільш широко для осадження ферментів використовуються етиловий спирт, ацетон і ізопропіловий спирт. Рідше застосовуються метанол, н-пропанол, діоксан, 2-метоксиетанол і інші спирти, кетон, ефіри та їхні суміші. При виборі розчинника необхідно пам'ятати про його можливу токсичність, вибухонебезпечність і можливість регенерації. З урахуванням цього найбільш придатними для виробництва є етанол і ізопропанол, менше – ацетон. Найбільш перспективним вважається осадження ферментів ізопропанолом. Осадження білків здійснюється при порівняно низькій його концентрації (52 –53%), і препарати містять на 40 – 45% менше баластних речовин, ніж за осадження ацетоном і особливо етанолом.

Наявність в розчині деяких іонівможе мати стабілізуючу дію на фермент. Так, іони Са⁺² здатні до зберігання активності a-амілази, протеїназ, глюкоамілаз; захисною дією характеризуються іони магнію, марганцю, кобальту. Наявність електролітів часто дозволяє знизити витрату осадника і покращити структуру осаду.

Фракційне розділення ферментів органічними розчинниками. Різна розчинність ферментів в органічних розчинниках дозволила розробити способи їхнього розділення.

Так, розроблено метод фракційного осадження амілолітичних і протеолітичних ферментів з екстрактів культури A. oryzae за допомогою етилового спирту. За концентрації спирту в розчині 50% осаджується 70 – 80% протеаз, а амілази осаджуються лише на 5%. Підвищення концентрацій спирту в розчині не приводить до збільшення кількості осаджених протеаз, а амілази майже на 100% осаджуються за концентрації спирту 70%. Використовуючи ці властивості ферментів розроблено технологію отримання амілаз і протеаз з фільтратів глибинних культур. Для цього в розчин, що містить ферменти, додають етиловий спирт до концентрації 52-54%. З отриманої водно-спиртової суміші за допомогою сепаратора відділяють осад протеолітичних ферментів. Потім до водно-спиртової суміші повторно додають етиловий спирт до кінцевої концентрації 72%. З отриманою суміші за допомогою сепаратора виділяють осад амілолітичних ферментів.

Додавання одного об’єму ацетону до фільтрату культуральної рідини B. subtilis дозволяє майже повністю осадити амілази, за таких умов протеази осаджуються лише на 4-8%.

За допомогою фракціонування етиловим спиртом може бути розділено комплекс ферментів, що міститься в екстракті поверхневої культури A. awamori. Повне осадження декстриназ відбувається за концентрації етанолу 79%, амілази і протеази осаджуються за концентрації 73%, мальтаза повністю осаджується за концентрації спирту 66%.

Осадження ферментів висококонцентрованими розчинами солей (висолювання). Процес висолювання ферментів в основному залежить від ступеня гідрофобності білкової молекули. Типова білкова молекула має гідрофобні ділянки на поверхні у вигляді бічних ланцюгів низки амінокислот (тирозин, триптофан, лейцин, ізолейцин, метіонін, валін і фенілаланін). На гідрофобних ділянках молекули білка при контакті з водою відбувається утворення шару, що складається з орієнтованих молекул води.

Але таке впорядкування структур є термодинамічно нестійким, оскільки в такій системі відбувається значне зниження ентропії в порівнянні з системою негідратований білок–вільні молекули води. Якщо молекули води імобілізувати молекулами небілкової природи, то білкові молекули починають взаємодіяти і відбувається їхня агрегація. Відомо, що іони солей гідратуються, і при додаванні значної кількості солі відбувається зв’язування води, білок частково звільняється від води і створюються умови для агрегації білкових молекул.

Різні білки по-різному реагують на процес висолювання. Це залежить в першу чергу від кількості і розмірів гідрофобних ділянок на поверхні білкової молекули. Чим більше таких ділянок, тим легше відбувається висолювання білків. Існують білки, які навіть при дуже високій концентрації солі в розчині майже не агрегують і не випадають в осад. При осадженні ферментів зі складної суміші різноманітних білків має місце явище соосадження. Після дегідратації білкових молекул в розчині солей молекули білка агрегують не з ідентичним, а з будь-якими іншими клейкими молекулами, що знаходяться поблизу. Це приводить до отримання препаратів, збагачених різними супутніми речовинами. Проте при висолюванні можна досягти не лише осадження всього комплексу ферментів, але і його фракціонування.

Хоча висолювання білків в основному визначається гідрофобними взаємодіями, на цей процес істотно впливають і інші чинники: рН середовища, близькість його до ізозлектричною точкою білка, температура, ступінь чистоти ферментного розчину, тривалість процесу і т.д.

Для висолювання в основному використовуються нейтральні солі лужних металів. Висолюючий ефект різних іонів залежить від їх іонної сили. Для висолювання можуть бути використані сульфат амонію, сульфат натрію, сульфат цинку і хлористий натрій. Найчастіше використовують сульфат амонію, рідше - хлористий натрій. Найбільше осадження білків відбувається при концентрації солі в розчині, близької до концентрації насичення. Але це не завжди зручно, так як в осад разом з білком захоплюється велика кількість солі, що вимагає додаткового очищення препаратів і ускладнює їх застосування. Звичайно осадження ведуть розчином з концентрацією солі 0,5 – 0,9 від повного насичення, але і в цьому випадку в препарати переходить від 20 до 80% солі від маси осаду.

Найскладніша стадія процесу висолювання – це внесення солі і спосіб її розчинення. Сіль подрібнюють і поволі додають невеликими порціями при постійному перемішуванні, щоб уникнути локальних зон підвищення концентрації солі в розчині. Після введення останньої порції солі перемішування необхідно продовжити ще 20 – 40 хв до досягнення повної рівноваги між розчиненими і агрегованими білками. Утворення осаду починається із слабкого помутніння яке поступово переходить у суспензію із зваженими пластівцями. Процес формування осаду залежить від температури, об'єму рідини рН середовища і може тривати від 20 – 40 хв. до декількох годин.

Осадження ферментів органічними полімерами. Білки можуть агрегуватися без денатурації під дією різних високомолекулярних нейтральних водорозчинних полімерів. Для осадження і виділення ферментів використовуються декстрани і поліетіленгліколь двох типів з молекулярними масами 6000 і 20000. Осадження білків в розчинах ПЕГ схоже з їх осадженням в органічних розчинниках. Так, розчинність ферментів в розчинах ПЕГ зростає при відхилення рН від їх ізоелектричної точки. Але для проведення осадження потрібні низькі концентрації ПЕГ. Поліетіленгліколь можна додавати у вигляді (50%) водного розчину до вмісту його в суміші 6 – 12%. Процес можна проводити при кімнатній температурі, оскільки ПЕГ має на білок стабілізуючу дію. Сам реактив порівняно дешевий. ПЕГ важче видалити з ферментної фракції, чим сіль або органічний розчинник, але оскільки він не впливає негативно на білок при його подальшому виділені (висолювання, іонообмінна хроматографія адсорбція і інше), його часто не видаляють зовсім.

Осадження ферментів шляхом вибіркової денатурації. Цей спосіб виділення прийнятний лише для стабільних ферментів, які зберігають стійкість за екстремальних умов. Наприклад, глюкозоізомерази, яка витримує температуру до 90-95°С. Для проведення вибіркової денатурації використовують три фактора: високу температуру, рН і дію органічних розчинників, які можна застосовувати окремо або комбінувати їх.

Термічна денатурація нецільових білків доситьо часто застосовується на початкових стадіях очищення термостабільних ферментів. Для захисту основного ферменту при термообробці можна використовувати специфічний стабілізуючий ефект субстрату, за присутності якого фермент краще переносить нагрівання. Температурна вибіркова денатурація вимагає дотримання умов проведення процесу: температури, тривалість обробки, швидкості охолодження і особливо рН середовища. Цей спосіб частіше використовується в лабораторних дослідженнях і дуже рідко на виробництві.

Вибіркова денатурація під впливом рН – більш розповсюджений прийом очищення і фракціонування ферментів ніж термічна денатурація. Суть методу полягає в тому, що за екстремальних значень рН відбувається денатурація нецільових білків, а цільовий фермент залишається в розчині.