Данный раздел был принят в 2012 году и в настоящее время рассматривается вопрос о его пересмотре

 

Идентификация возбудителя

 

 

Любое подозрение на чуму КРС считается потенциальной угрозой для международной биобезопасности и подлежит немедленному подтверждению или исключению методами дифференциальной диагностики. В случае подтверждения диагноза необходимо принять меры к отслеживанию источника заражения при условии выделения вируса, идентификации его линии и определения вирулентности на экспериментальных животных (Anderson et al., 1996). Для данных целей имеются различные методы.

 

Предпочтительным образцом, по возможности, является кровь в антикоагулянте. Как правило, виремия возникает немного раньше, чем гипертермия и может сохраняться в течение 1-2 дней после начала ослабления лихорадки. Следовательно, у животных с гипертермией в крови, скорее всего, будет присутствовать вирус, поэтому они лучше всего подходят для взятия проб с целью выделения вируса. Однако, учитывая, что у отдельных животных с лихорадкой виремия может отсутствовать, на исследование необходимо отправлять образцы от нескольких животных с гипертермией. Важно обеспечить, чтобы патологического материала хватило для проведения, как минимум, двух попыток выделения вируса из образцов, отобранных при первоначальном подозрении на вспышку. Другие описываемые процедуры проводят только при наличии дополнительного количества патологического материала.

 

Выделение вируса

 

Вирус чумы КРС можно выделить методом культивирования из лейкоцитарной фракции цельной крови, собранной в гепарин или ЭДТК (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в конечной концентрации равной 10

международных единиц (МЕ/мл) и 0,5 мг/мл, соответственно. Образцы тщательно смешивают и доставляют в лабораторию на льду, но не замораживая. Вирус можно также выделить из образцов селезенки, предлопаточных и мезентериальных лимфоузлов павших животных; эти образцы можно замораживать для транспортировки; транспортировка должна осуществляться при соблюдении принципов биозащиты в соответствии с международными регламентами по транспортировке, описанными в Главе 1.1.2 Сбор, предоставление и хранение диагностических проб, Главе 1.1.3 Транспортировка проб животного происхождения, а также в соответствии с Руководствами по секвестрации вируса чумы КРС.

 

Для выделения вируса из крови, некоагулированную кровь центрифугируют при 2 500 g в течение 15 минут до образования слоя лейкоцитарной пленки между слоями плазмы и эритроцитов. Пленку отделяют настолько чисто, насколько это возможно, смешивают с 20 мл физиологического раствора и снова центрифугируют в качестве отмывки для удаления любых нейтрализующих антител, присутствующих в плазме. Получившийся клеточный осадок суспендируют в поддерживающей среде для культур клеток и аликвотами по 2 мл наносят на монослои первичных клеток почки теленка, T лимфобласты КРС, трансформированные лимфобластоидными клетками мартышки B95a, или клетки (Vero) почки африканской зеленой мартышки в роллерных пробирках. Культуральную поддерживающую среду сливают и заменяют каждые 2-3 дня, монослои исследуют под микроскопом на предмет развития цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Цитопатогенный эффект характеризуется преломлением, округлением клеток, ретракцией клеток с вытянутыми цитоплазматическими мостиками (звездчатые клетки) и/или образованием синцитий. Скорость развития цитопатогенного эффекта варьирует в зависимости от субстрата и, вероятно, также от штамма вируса. В первичных клетках это занимает до 12 дней, в клетках Vero – неделю, а в клетках В95а – 2-4 дня. До объявления важных образцов отрицательными возможно проведение слепых пассажей, но предпочтительным методом является введение клеточной суспензии или остатка оригинального образца внутривенно восприимчивому к чуме КРС быку с последующим повторным выделением вируса из его крови. Частичная идентификация изолятов вируса путем демонстрации специфичных для морбилливируса преципитиногенов в остатке инфицированных клеток, а полная – путем демонстрации специфической иммунофлуоресценции с использованием конъюгированных моноклональных антител (Маb).

 

Иным образом, можно использовать 20% суспензии (в отношении массы к объему) лимфоузлов или селезенки. Для приготовления таких суспензий твердые ткани мацерируют в бессывороточной поддерживающей культуральной среде с помощью стандартных гомогенизаторов или резаков, а затем вносят в описанные ранее монослои. Высвобождения вируса из твердых тканей можно добиться несколькими способами. Самый простой – с использованием пестика и ступки, хотя для этой процедуры в качестве абразивного материала нужен стерильный песок. Также ткани можно размолоть без абразива, используя цельностеклянный гомогенизатор, например, гомогенизатор Ten Broeck. Также возможно применение методов резки, например, с помощью блендеров Silverson или Waring. Вирусосодержащие суспензии очищают центрифугированием на низкой скорости. Объем посевного материала не имеет значения; рабочий объем составляет от 1 до 2 мл. В качестве антибиотиков чаще всего используют пенициллин в сочетании со стрептомицином, каждый в концентрации 100 МЕ/мл. Такой же покровный слой широкого спектра действия дает неомицин в

концентрации 50 мкл/мл. Кроме этого, включают фунгизон в концентрации 2,5 мкг/мл.