Чума крупного рогатого скота

ЧУМА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(ИНФЕКЦИЯ ВИРУСОМ ЧУМЫ КРС)

 

 

РЕЗЮМЕ

 

В прошлом классическая чума крупного рогатого скота (КРС) являлась острым, вирусным заболеванием КРС, яков, диких африканских буйволов (Syncerus caffer) и азиатских буйволов (Bubalus bubalis), характеризующимся высокой заболеваемостью и смертностью. Инфекция также могла поражать овец, коз, свиней и диких копытных. В период с 2002 по 2011 годы полевых случаев чумы КРС зарегистрировано не было. Кампания по искоренению данного заболевания завершилась в 2011 г. декларацией глобальной свободы от чумы КРС.

 

Существующие коллекции вирулентных и аттенуированных вирусов чумы КРС, хранящиеся в исследовательских лабораториях и на зарегистрированных предприятиях по производству вакцин, подлежат секвестрации. С целью не допущения случайной утечки вируса из лаборатории Всемирная организация по охране здоровья животных (МЭБ) совместно с ФАО 1 придерживается стратегии международного надзора и регулирования учреждений, в которых хранится вирус чумы КРС. Все диагностическая, исследовательская деятельность и деятельность по производству вакцин, в которых используется вирус чумы КРС или материалы, содержащие вирус чумы КРС, должны осуществляться только в учреждении, поднадзорном ФАО/МЭБ.

1 ФАО: Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН

 

Чума КРС остается заболеванием, подлежащим уведомлению в МЭБ, и в связи с этим на случай неожиданной утечки вируса продолжают действовать соответствующие программы надзора с целью раннего выявления клинических случаев болезни. МЭБ (совместно с ФАО) будет обеспечивать постоянный доступ к обучающим материалам, содержащим описание клинических признаков чумы КРС у живых животных.

 

Описание болезни: Клиническая диагностика классической чумы КРС начинается с обнаружения погибшего животного или небольшой группы сильно пораженных животных с одним или более из следующих признаков: повышение температуры тела, отсутствие аппетита, угнетенное состояние, истощение, поверхностные эрозии в области верхней и нижней губы и десны, изъязвление или сглаживание щечных сосочков, серозные или слизисто-гнойные выделения из глаз и/или носа, диарея и лежачее положение в терминальной стадии. Вероятнее всего, в группе будет несколько павших животных с такими поражениями. Более подробное описание клинических признаков представлено части «Введение» данной главы.

 

Идентификация возбудителя: В основе лабораторного подтверждения лежит демонстрация присутствия вируса, вирус-специфической РНК или преципитирующих антигенов в образцах селезенки, лимфоузлов или выделений из носа и глаз животных с острой формой заражения.

 

Серологические тесты: Для обнаружения антител к вирусу чумы КРС у животных с подозрением на полевую инфекцию или вакцинированных против чумы КРС используют конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Выбранный тест должен быть чувствительным к той линии вируса, которая, вероятно, вызвала

заражение, а также обладать высокой специфичностью. В этих же целях также проводят оценку уровня нейтрализующих антител. Как и в случае с вирусом, исследования проб сыворотки от животных с подозрением на чуму КРС могут проводиться только в утвержденных МЭБ лабораториях, обеспечивающих высокую степень биобезопасности.

 

Требования к вакцинам: Существует живая аттенуированная вакцина против чумы КРС на основе культуры клеток. На данный момент вакцинация против чумы КРС разрешена только в условиях вивария. В связи с тем, что учреждения, в которых содержится вирус чумы КРС, находятся под наблюдением и контролем международных компетентных органов, хранение вакцинного посевного вируса и дальнейшие манипуляции с ним могут происходить только под надзором международных организаций.

 

С целью подготовки к возможной случайной утечке вируса чумы КРС и согласно международному соглашению о секвестрации ФАО и МЭБ совместно со странами-членами разработали стратегический план для постэрадикационного периода, включающий международный план по действиям в чрезвычайной ситуации и предусматривающий назначение минимального количества референтных центров/лабораторий и создание банков вакцин для вынужденной вакцинации.

 

А. ВВЕДЕНИЕ

 

В прошлом классическая чума крупного рогатого скота (КРС) являлась острым, вирусным заболеванием КРС, яков, диких африканских буйволов (Syncerus caffer) и азиатских буйволов (Bubalus bubalis), характеризующимся высокой заболеваемостью и смертностью. Инфекция также могла поражать овец, коз, свиней и диких копытных. В период с 2002 по 2011 гг. полевых случаев чумы КРС зарегистрировано не было. Кроме того, в период до января 2011 г. Научный комитет по болезням животных МЭБ внимательно изучил обширный список заявок, поступивших из стран по всему миру (как научно-обоснованных, так и подтвержденных историческими данными), на признание страны свободной от чумы КРС. Этот процесс завершился в 2011 г. декларацией глобальной свободы от чумы КРС.

 

В ближайшем будущем существующие коллекции вирулентных и аттенуированных вирусов чумы КРС, хранящиеся в исследовательских лабораториях и на зарегистрированных предприятиях по производству вакцин, подлежат секвестрации. С целью не допущения случайной утечки вируса из лаборатории Всемирная организация по охране здоровья животных (МЭБ) совместно с ФАО следует принципам международного надзора и регулирования учреждений, в которых хранится вирус чумы КРС, за счет сведения к минимуму количества хранилищ. Все диагностическая, исследовательская деятельность и деятельность по производству вакцин с применением вируса чумы КРС или материалов, содержащих вирус чумы КРС, должна осуществляться только в учреждении, поднадзорном ФАО/МЭБ.

 

Чума КРС остается заболеванием, подлежащим уведомлению в МЭБ, и в связи с этим на случай неожиданной утечки вируса продолжают действовать соответствующие программы надзора с целью раннего выявления клинических случаев болезни. МЭБ (совместно с ФАО) будет обеспечивать постоянный доступ к обучающим материалам, содержащим описание клинических признаков чумы КРС у живых животных. Опубликовано последнее изложение истории чумы КРС, ее искоренения и социально-экономического влияния (Roeder & Rich, 2009).

 

Возбудителем чумы КРС является вирус с РНК с отрицательной цепью, который относится к роду Morbillivirus семейства Paramixoviridae. Вирус существует в виде трех

ветвей, четко различающихся по своему географическому распространению: африканских линий 1 и 2 и азиатской линии 3, при этом вакцинация против одной из ветвей обеспечивает полноценную защиту против двух других, а дифференциацию вирусов, принадлежащих к разным ветвям, осуществляют только молекулярными методами. Вакцинный вирус чумы КРС на основе тканевой культуры был получен из другого генетически отличного вируса, занесенного в Африку из Азии в 19-ом веке. Классическое описание чумы КРС представляет собой следующее: чума КРС – болезнь домашнего КРС, яков, диких африканских буйволов и азиатских буйволов с высокой смертностью. Вирус также поражает свиней и многие другие виды диких животных отряда Artiodactyla, хотя не всегда в клинически выраженной форме; последние исследования показали, что овцы и козы также являются восприимчивыми животными, однако, их эпизоотологическая значимость как хозяев вируса невелика (Taylor & Barrett, 2007).

 

Хотя со временем некоторые штаммы чумы КРС стали вызывать только легкую, несмертельную форму инфекции, все штаммы сохраняют два очень опасных свойства: во-первых, почти обязательная способность изменять вирулентность и, во-вторых, способность заражать некоторые виды диких животных, а у таких видов, как африканский буйвол, антилопа канна, жираф, малый куду и бородавочник, вызывать острую инфекцию с высокой смертностью.

 

Чума КРС не является зоонозным заболеванием, однако, с вирусом или материалами, содержащими вирус, следует обращаться в соответствии со строгими правилами биозащиты, описанными в Главе 1.1.4 Биобезопасность и биозащита: Руководство по управлению биологическими рисками в ветеринарной лаборатории и виварии, а также согласно Руководствам по секвестрации вируса чумы КРС.

 

Иллюстрированное описание болезни представлено в Атласе МЭБ трансграничных болезней животных (Fernandez & White, 2010). Инкубационный период классической формы чумы КРС составляет от 1 до 2 недель, клинические признаки включают острые приступы лихорадки, во время которых можно различить продромальные и эрозивные стадии. Продромальная стадия продолжается около 3 дней, во время этой фазы у животного наблюдается повышение температуры до 40-41,5ºC, сопровождающееся частичной потерей аппетита, запорами, отеком видимых слизистых оболочек, серозными выделениями из глаз и носа, угнетенным состоянием и сухостью носового зеркала. Однако подозрение на заболевание появляется только после наступления эрозивной стадии и возникновения некротических поражений ротовой полости. Во время лихорадки 

на слизистой нижней губы и десны начинают появляться некротические очаги, которые быстро распространяются на верхнюю десну и твердый мозолистый валик, на нижнюю поверхность языка, на щеки и щечные сосочки, а также на твердое нёбо. По мере увеличения уже существующих очагов и появления новых в течение последующих 2-3 дней некроз быстро распространяется по всей полости рта. Большая часть отмершей ткани отпадает, обнажая участки поверхностного, негеморрагического эрозирования эпителия слизистых.

  

Диарея, еще один характерный признак чумы КРС, появляется через 1-2 дня после возникновения поражений в ротовой полости. Как правило, сначала диарея проявляется обильным и водянистым стулом, в котором позднее появляются слизь, кровь и частицы эпителия, в тяжелых случаях диарея может сопровождаться тенезмами. Во время эрозивной фазы некроз может наблюдаться в ноздрях, в вульве и влагалище, а также на препуциальной оболочке. У животных отмечается отсутствие аппетита, полное пересыхание носового зеркала, угнетенное и истощенное состояние, запах сероводорода при выдохе, слизисто-гнойные выделения из носа и глаз.

 

Показатели гибели животных зависят от штамма вируса, породы КРС и условий окружающей среды; уровень смертности варьирует от 100% (сверхострые штаммы у европейских пород КРС) до 20-30% (острые штаммы у зебу) и 0% (слабоактивные штаммы у зебу). Уровень смертности, вызванной острыми или слабоактивными штаммами, однако, может возрасти по мере распространения вируса среди большого количества восприимчивых животных. На терминальных стадиях заболевания животное находится в лежачем положении в течение 24-48 часов перед смертью. Некоторые животные погибают вследствие развития тяжелых некротических поражений, выраженного лихорадочного состояния, истощения и диареи, другие – после резкого снижения температуры тела, часто, до субнормальных значений. У выживших животных лихорадка немного ослабевает во время эрозивного периода, а затем – через 2-3 дня – температура тела быстро приходит в норму на фоне быстрого разрешения поражений в полости рта, прекращения диареи и выздоровления без осложнений.

 

В случае подозрения на чуму КРС во время аутопсии павшего животного следует обратить особое внимание на сычуг, который при поражении вирусом чумы КРС будет выглядеть налитым кровью или серого цвета, на пейеровы бляшки с возможными признаками некроза лимфоидной ткани, а также на отек и потемнение гребней складчатой структуры слепой, толстой и прямой кишки. Дифференциальную диагностику у КРС следует проводить с учетом таких заболеваний, как вирусная диарея КРС/болезнь слизистых оболочек и злокачественная катаральная лихорадка с использованием соответствующих лабораторных методов. Диагностика (дифференциальная диагностика) чумы КРС может осуществляться только в утвержденных МЭБ лабораториях, обеспечивающих надлежащий уровень биозащиты.

 

Обычно трупы погибших животных выглядят обезвоженными, истощенными и грязными. На носу и щеках присутствуют следы слизисто-гнойных выделений, глаза запавшие, конъюнктива гиперемирована. В ротовой полости часто обнаруживают обширное отшелушивание некротизированного эпителия, участки которого всегда четко отделены от прилегающих участков здоровой слизистой. Поражения часто охватывают мягкое небо, а иногда и глотку и верхний отдел пищевода; рубец, сетка и книжка обычно не поражены; хотя иногда на дугах рубца встречаются некротические бляшки. Выраженные поражения сычуга, особенно, антрального отдела характеризуются гиперемией и петехиями, а также отеком подслизистой. Некроз эпителия придает слизистой оболочке серый цвет. Тонкий кишечник, как правило, не затронут за исключением выраженных изменений в пейеровых бляшках, которые в результате некроза лимфоидной ткани и отслоения некротизированных тканей выглядят отечными или потемневшими. Изменения в толстой кишке затрагивают илеоцекальный клапан, лимфатические фолликулы слепой кишки, а также гребни продольных складок слизистой оболочки слепой, толстой и прямой кишки. В острых случаях со смертельным исходом складки сильно воспалены, а в случае продолжительной болезни – темного цвета; в любом случае такие поражения называют «полосками зебры».

 

Примером легкой формы чумы КРС может служить инфекция, вызываемая вирусом чумы КРС 2 африканской линии в эндемических областях восточной Африки, инкубационный период при которой составлял от 1 до 2 недель, а клинические проявления у КРС ограничивались подострыми приступами лихорадки. Повышение температуры наблюдалось не всегда; иногда лихорадка держалась всего 3-4 дня с повышением температуры всего до 38-40ºC. У животных с легкой формой болезни отсутствовало угнетенное состояние, характерное для более острых форм чумы КРС. Диарея, если возникала, носила слабовыраженный характер. При более тщательном обследовании обнаруживали небольшую отечность видимых слизистых оболочек и небольшие очаги беловатого цвета на нижней десне, представлявшие собой участки воспаленного, некротизированного эпителия (иногда размером не больше булавочной головки), а также

эрозированные щечные бугорки. У некоторых животных такие поражения вообще отсутствовали либо быстро проходили сразу после возникновения. У других животных наблюдались незначительные серозные выделения из глаз или носа, но – в отличие от случаев более тяжелой формы заболевания – они не становились слизисто-гнойными.

 

Даже если заражение мягкой формой чумы КРС могло остаться у КРС незамеченным, вирус сохранял свою высокую инфекционность для диких животных, при этом у наиболее восприимчивых видов (лесные антилопы, например, малый куду и антилопа канна, африканские буйволы и жирафы) он вызывал лихорадку, выделения из носа, типичный эрозивный стоматит, гастроэнтерит и гибель. Kock (2006) также наблюдал, что кроме этого у африканских буйволов, инфицированных вирусом генетической линии 2, отмечалось увеличение периферических лимфоузлов, бляшкоподобные кератинизированные поражения кожи и кератоконъюнктивит. Поражения у малых куду выглядели так же, но если слепота, связанная с тяжелым кератоконъюнктивитом, была частым явлением, диарея встречалась намного реже. У антилоп канна болезнь, как правило, манифестировала некротическими и эрозивными поражениями слизистой щек на фоне обезвоживания и истощения. В связи с вышесказанным, в данных обстоятельствах обнаружение чумы КРС у любого из этих видов животных указывает на вероятность одновременной передачи вируса, даже на субклиническом уровне, стадам КРС, пасущимся в непосредственной близости, а также на возможное распространение инфекции через торговлю живыми животными.

 

 

В. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

 

Идентификация возбудителя

 

 

Любое подозрение на чуму КРС считается потенциальной угрозой для международной биобезопасности и подлежит немедленному подтверждению или исключению методами дифференциальной диагностики. В случае подтверждения диагноза необходимо принять меры к отслеживанию источника заражения при условии выделения вируса, идентификации его линии и определения вирулентности на экспериментальных животных (Anderson et al., 1996). Для данных целей имеются различные методы.

 

Предпочтительным образцом, по возможности, является кровь в антикоагулянте. Как правило, виремия возникает немного раньше, чем гипертермия и может сохраняться в течение 1-2 дней после начала ослабления лихорадки. Следовательно, у животных с гипертермией в крови, скорее всего, будет присутствовать вирус, поэтому они лучше всего подходят для взятия проб с целью выделения вируса. Однако, учитывая, что у отдельных животных с лихорадкой виремия может отсутствовать, на исследование необходимо отправлять образцы от нескольких животных с гипертермией. Важно обеспечить, чтобы патологического материала хватило для проведения, как минимум, двух попыток выделения вируса из образцов, отобранных при первоначальном подозрении на вспышку. Другие описываемые процедуры проводят только при наличии дополнительного количества патологического материала.

 

Выделение вируса

 

Вирус чумы КРС можно выделить методом культивирования из лейкоцитарной фракции цельной крови, собранной в гепарин или ЭДТК (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в конечной концентрации равной 10

международных единиц (МЕ/мл) и 0,5 мг/мл, соответственно. Образцы тщательно смешивают и доставляют в лабораторию на льду, но не замораживая. Вирус можно также выделить из образцов селезенки, предлопаточных и мезентериальных лимфоузлов павших животных; эти образцы можно замораживать для транспортировки; транспортировка должна осуществляться при соблюдении принципов биозащиты в соответствии с международными регламентами по транспортировке, описанными в Главе 1.1.2 Сбор, предоставление и хранение диагностических проб, Главе 1.1.3 Транспортировка проб животного происхождения, а также в соответствии с Руководствами по секвестрации вируса чумы КРС.

 

Для выделения вируса из крови, некоагулированную кровь центрифугируют при 2 500 g в течение 15 минут до образования слоя лейкоцитарной пленки между слоями плазмы и эритроцитов. Пленку отделяют настолько чисто, насколько это возможно, смешивают с 20 мл физиологического раствора и снова центрифугируют в качестве отмывки для удаления любых нейтрализующих антител, присутствующих в плазме. Получившийся клеточный осадок суспендируют в поддерживающей среде для культур клеток и аликвотами по 2 мл наносят на монослои первичных клеток почки теленка, T лимфобласты КРС, трансформированные лимфобластоидными клетками мартышки B95a, или клетки (Vero) почки африканской зеленой мартышки в роллерных пробирках. Культуральную поддерживающую среду сливают и заменяют каждые 2-3 дня, монослои исследуют под микроскопом на предмет развития цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Цитопатогенный эффект характеризуется преломлением, округлением клеток, ретракцией клеток с вытянутыми цитоплазматическими мостиками (звездчатые клетки) и/или образованием синцитий. Скорость развития цитопатогенного эффекта варьирует в зависимости от субстрата и, вероятно, также от штамма вируса. В первичных клетках это занимает до 12 дней, в клетках Vero – неделю, а в клетках В95а – 2-4 дня. До объявления важных образцов отрицательными возможно проведение слепых пассажей, но предпочтительным методом является введение клеточной суспензии или остатка оригинального образца внутривенно восприимчивому к чуме КРС быку с последующим повторным выделением вируса из его крови. Частичная идентификация изолятов вируса путем демонстрации специфичных для морбилливируса преципитиногенов в остатке инфицированных клеток, а полная – путем демонстрации специфической иммунофлуоресценции с использованием конъюгированных моноклональных антител (Маb).

 

Иным образом, можно использовать 20% суспензии (в отношении массы к объему) лимфоузлов или селезенки. Для приготовления таких суспензий твердые ткани мацерируют в бессывороточной поддерживающей культуральной среде с помощью стандартных гомогенизаторов или резаков, а затем вносят в описанные ранее монослои. Высвобождения вируса из твердых тканей можно добиться несколькими способами. Самый простой – с использованием пестика и ступки, хотя для этой процедуры в качестве абразивного материала нужен стерильный песок. Также ткани можно размолоть без абразива, используя цельностеклянный гомогенизатор, например, гомогенизатор Ten Broeck. Также возможно применение методов резки, например, с помощью блендеров Silverson или Waring. Вирусосодержащие суспензии очищают центрифугированием на низкой скорости. Объем посевного материала не имеет значения; рабочий объем составляет от 1 до 2 мл. В качестве антибиотиков чаще всего используют пенициллин в сочетании со стрептомицином, каждый в концентрации 100 МЕ/мл. Такой же покровный слой широкого спектра действия дает неомицин в

концентрации 50 мкл/мл. Кроме этого, включают фунгизон в концентрации 2,5 мкг/мл.

 

Серологические тесты

 

 

Процедура теста

 

 

i i) Лиофилизированный антиген вируса чумы КРС восстанавливают с помощью 1 мл стерильной воды и разводят до рекомендованного производителем рабочего разведения, используя 0,01 М фосфатно-буферный раствор, рН 7,4.

 

 

i ii) Сразу после этого разведенный антиген в объемах по 50 мкл распределяют по соответствующему количеству лунок на плоскодонном микропланшете для ИФА, обеспечивающем высокий уровень связывания белка, выделяя по две лунки для каждой исследуемой сыворотки. Чтобы равномерно распределить антиген по дну каждой лунки, нужно слегка постучать по бокам микропланшета, затем запечатать его и инкубировать на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC. Лунки промывают три раза 0,002 М фосфатно-буферным раствором, pH 7,4.

 

 

i iii) В каждую тест-лунку вносят 40 мкл блокирующего буфера (0,01 М ФБР, 0,1% (в объемном отношении) Тween 20 и 0,3% (в объемном отношении) нормальной бычьей сыворотки), а затем вносят все исследуемые сыворотки в объемах по 10 мкл.

 

 

i iv) Рабочее разведение моноклонального антитела в блокирующем буфере готовят в соответствии с рекомендациями производителя и вносят по 50 мкл разведенного моноклонального антитела в каждую тест-лунку. Планшеты запечатывают и снова инкубируют на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC.

 

 

i v) Рабочее разведение кроличьего антимышиного иммуноглобулина, конъюгированного с пероксидазой хрена, в блокирующем буфере готовят в соответствии с рекомендациями производителя и вносят по 50 мкл иммуноглобулина в каждую тест-лунку. Планшеты запечатывают и снова инкубируют на шейкере с орбитальным вращением в течение 1 часа при 37ºC.

 

 

i vi) В конце этого этапа планшеты промывают, как указано выше, и сразу снова наполняют смесью субстрата и хромогена в объемах по 50 мкл (1 часть 3% Н2О2 к 250 частям орто-фенилендиамина) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут без встряхивания. Затем вносят 50 мкл стоп-раствора, состоящего из 1 М серной кислоты.

 

 

i vii) Данная тест-система должна включать положительные и отрицательные сыворотки, контроль для моноклонального антитела и контроль для конъюгата.

 

 

i viii) Полученные показатели оптической плотности измеряют на ИФА-ридере с интерференционным фильтром 492 нм и переводят в значения процента ингибирования в сравнении со значением, полученным при использовании контроля для моноклонального антитела. Значения процента ингибирования 50% и более указывают на положительный результат теста, значения ниже 50% - на отрицательный.

 

 

Снижение порога разграничения положительного/отрицательного результата до 40% и ниже повышает чувствительность теста, но негативно отражается на специфичности ввиду увеличения доли ложноположительных результатов теста. На практике, значение 50% рекомендовано GREP, при этом чувствительность теста составляет на менее 70%, а специфичность – более 99%. Чувствительность

следует учитывать при разработке планов отбора проб для серологического надзора.

 

Нейтрализация вируса

 

Золотой стандарт исследования – реакцию нейтрализации вируса – проводят на культурах первичных клеток почки теленка в роллерных пробирках методом Plowright & Ferris (1961); тест валидирован на экспериментально инфицированном КРС. В ходе процедуры, осуществляемой в роллерных пробирках, неинактивированные сыворотки разводят в интервалах от 1 до 10, затем, начиная с неразведенной сыворотки, смешивают с равным объемом аттенуированного вакцинного вируса штамм Kabete «O» в дозе 103,0 ТЦД50/мл. Смеси инкубируют в течение ночи при 4ºC, затем в каждую из пяти роллерных пробирок вносят по 0,2 мл, с последующим немедленным введением 1 мл диспергированных индикаторных клеток, суспендированных в ростовой среде в соотношении 2×105 клеток/мл. Пробирки инкубируют при 37ºC в течение первых трех дней в наклонном положении, затем повторно наполняют поддерживающей средой и помещают в роллер. Пробирки регулярно исследуют на наличие вирус-специфического цитопатогенного действия, положительные пробирки учитывают и убирают; окончательный учет результатов проводят на 10 день.

 

Для подсчета конечных показателей доза вируса считается достаточной, если конечное разведение находится в диапазоне от 101,8 до 102,8 ТЦД50/пробирку. Данный тест следует использовать для исследования сывороток от животных с положительной реакцией в ИФА в ходе национальных программ по серологическому надзору, проводимых с целью демонстрации свободы от инфекции или с целью отбора восприимчивого КРС для испытаний вакцины. В данных обстоятельствах считается, что присутствие любого количества обнаруживаемых антител в ½ конечного разведения сыворотки указывает на перенесенную инфекцию вирусом чумы КРС. Реакция нейтрализация вируса – является методом выбора при исследовании образцов сыворотки от диких животных.

 

В качестве скрининг-теста применяют метод с использованием микропланшетов. Для этого теста первоначальное разведение сыворотки (1/5) дополнительно разводят с двукратными интервалами. Затем сыворотку в объемах по 50 мкл инкубируют с вирусом в объемах по 50 мкл, разведенным таким образом, чтобы ТЦД50 разведения составлял от 101,8 до 102.8 (Taylor & Rowe, 1984). После инкубирования в течение 45 минут или в течение ночи вносят от 1 до 2 × 105 клеток почки теленка, клеток почки ягненка или Vero клеток в качестве индикаторов. Реакцию останавливают через 6-7 дней. При высоких концентрациях сыворотки в таких тестах может возникать неспецифическая нейтрализация. По-видимому, в некоторых сыворотках от здоровых животных (без перенесенной инфекции чумы КРС) могут присутствовать факторы, которые обуславливают неспособность вируса проникать и реплицироваться в индикаторных клетках. В ходе реакции в пробирках влияние данных факторов, вероятно, нивелируется во время смены поддерживающей среды; при проведении теста на микропланшетах данные факторы присутствуют в течение всего периода исследования. Если наивысшая концентрация конечного разведения сыворотки не превышает 1/10, то данный эффект исчезает.

 

 

С. ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИНАМ И ДИАГНОСТИЧЕСКИМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ

 

Общая информация

 

Критерии качества

 

i i) RBOK и LA-AKO

 

 

Необходимо подтвердить, что посевной материал как RBOK, так и LA-AKO является:

 

� a) Чистым

 

 

То есть свободным от контаминации вирусами, бактериями, грибами или микоплазмами.

 

� b) Безопасным

 

 

То есть не вызывающим клинической реакции при введении КРС, восприимчивому к чуме КРС.

 

� c) Эффективным

 

 

То есть индуцирующим иммунитет к чуме КРС у КРС, восприимчивому к данному заболеванию.

 

Метод производства

 

Процедура

 

i i) RBOK

 

 

Отдельные серии вакцины производят посредством заражения клеточных культур с последующим – после соответствующего периода инкубирования – сбором покрывающей среды, в которой в больших количествах присутствуют высвобожденные частицы живого вируса. Вирус можно выращивать в первичных культурах клеток почки эмбрионов КРС или телят или в гомогенатах клеток, полученных в результате не менее чем десяти пересевов одной из вышеуказанных культур. Кроме того, вакцину можно производить в утвержденных перевиваемых клеточных культурах при условии, что клетки не инфицированы случайно занесенными вирусами, включая вирус вирусной диареи КРС, и поддерживаются в системе посевных материалов.

 

Вирусный материал собирают с культур, инкубируемых в роллерных флаконах, не позднее чем через 10 дней после их инфицирования. Правильный момент для сбора вирусного материала определяют по наличию обширного характерного ЦПЭ внутри клеточного монослоя. Для формирования промышленной суспензии собранный вирусный материал очищают центрифугированием на низкой скорости, а затем вносят криопротектор.

 

Из одного и того же набора культур разрешается произвести два сбора, которые можно объединить для образования одной суспензии. Все этапы производства вакцины должны быть описаны в соответствующем протоколе.

 

i ii) LA-AKO

 

 

Отдельные серии вакцины производят путем заражения клеток Vero восстановленным посевным материалом с последующим сбором покрывающей среды и инфицированных клеток, содержащих большое количество частиц живого вируса, после инкубирования в течение соответствующего периода времени. Серию вакцины также можно произвести из промышленной суспензии, содержащей вирус в соответствующей концентрации, поддерживаемой за счет нескольких серийных пересевов (до 10 раз). Кроме того, производство вакцины следует осуществлять в стерильных условиях в культуре, свободной от таких случайно занесенных агентов, как вирус вирусной диареи КРС, вирус лейкоза КРС и ротавирус КРС.

 

Вирусный материал собирают с культур, инкубируемых в роллерных флаконах, не позднее чем через 7 дней после их заражения. Правильный момент для сбора вирусного материала определяют по наличию обширного характерного ЦПЭ внутри клеточного монослоя. Для формирования промышленной суспензии собранный вирусный материал очищают центрифугированием на низкой скорости, а затем вносят криопротектор.

 

Все этапы производства вакцины должны быть описаны в соответствующем протоколе.

 

Для длительного хранения и реализации в режиме холодовой цепи промышленные суспензии лиофилизируют.

 

Требования к субстратам и средам

 

i) RBOK a) Клетки

b) Среды

c) Криопротектор

 

 

 

 

Первичные клетки, серийно культивированные первичные клетки или перевиваемые клеточные культуры получают от здоровых на вид животных или из нормальных эмбрионов, при этом все клеточные культуры должны сохранять нормальную морфологию во время культивирования. Клетки должны быть свободны от контаминации случайно занесенными вирусами, особенно, вирусом вирусной диареи КРС (см. ниже).

 

 

Клетки почки теленка выращивают и поддерживают в сбалансированном солевом растворе Эрла или в минимальной эссенциальной среде Игла с добавлением 0,5% гидролизата лактальбумина и 0,1% экстракта дрожжей, а также 5% сыворотки новорожденного теленка КРС, восприимчивого к чуме КРС, из стран с незначительным риском губкообразной энцефалопатии КРС.

 

Клетки Vero выращивают и поддерживают в среде Игла в модификации Глазго с добавлением 14% TPB и 6% сыворотки КРС (свободной от антител к вирусу чумы КРС), не подвергавшейся тепловой обработке, а также антибиотиков.

 

 

В качестве стабилизатора для лиофилизации используют раствор, содержащий равные объемы 5% гидролизата лактальбумина и 10% сахарозы.

 

i ii) LA-AKO

 

 

� a) Клетки

 

 

Во время культивирования перевиваемые культуры клеток Vero должны сохранять нормальную морфологию. Клетки должны быть свободны от контаминации случайно занесенными вирусами.

 

b) Среды d) Криопротектант

 

 

 

Клетки Vero выращивают и поддерживают в минимальной эссенциальной среде Игла с добавлением 10% нагретой фетальной телячьей сыворотки, 0,295% TPB, а также антибиотиков.

 

 

В качестве стабилизатора для лиофилизации используют раствор, содержащий равные объемы 1% глутамата натрия, 0,3% поливинилпиролидона и 10% сахарозы.

 

Требования для получения регистрационного удостоверения

 

Требования к безопасности

 

i i) Безопасность целевых и нецелевых видов животных

 

 

� a) RBOK и LA-AKO

 

 

Вакцина RBOK не вызывает клинических признаков у КРС или азиатских буйволов, восприимчивых к чуме КРС, Вакцина LA-AKO также не индуцирует никаких клинических признаков за исключением небольшого повышения температуры тела у КРС, восприимчивого к чуме КРС. Ни одна из вакцин не передается КРС, восприимчивому к чуме КРС, через контакт с вакцинированными животными, содержащимися в непосредственной близости.

 

i ii) Возврат к вирулентности

 

 

� a) RBOK и LA-AKO

 

 

Вакцинный вирус RBOK остается аттенуированным после не менее чем пяти обратных пассажей в КРС и не распространяется через контакт между животными. При производстве культуральной вакцины против чумы КРС с использованием любого субштамма вакцины RBOK или LA-AKO необходимо обеспечить возможность отслеживания происхождения вакцинного штамма от одного из вышеуказанных субштаммов.

 

i iii) Проблемы охраны окружающей среды

 

 

� a) RBOK и LA-AKO

 

 

При производстве или применении вакцины против чумы КРС не возникает проблем, связанных с охраной окружающей среды.

 

Требования к эффективности

 

i i) Для животноводства

 

 

� a) RBOK и LA-AKO

 

 

Обе вакцины обеспечивают защиту вакцинированных животных от клинической формы заболевания, вызываемого заражением вирулентным вирусом чумы КРС.

 

i ii) Для контроля и искоренения болезни

 

 

� a) RBOK и LA-AKO

 

 

С целью искоренения болезни необходимо как можно скорее вакцинировать всех восприимчивых животных внутри зоны вспышки и вокруг нее (Taylor et al., 2002).

 

Стабильность

 

i i) RBOK

 

 

Живая аттенуированная культуральная вакцина против чумы КРС при правильной лиофилизации обладает высокой стабильностью и может храниться в течение продолжительного периода времени при +4ºC или при –20ºC при условии, что в продукте сохраняется вакуум. Скорость деградации лиофилизированной вакцины может меняться в зависимости от выбранного стабилизатора и цикла сушки. Самые благоприятные результаты получали с использованием стабилизатора на основе 5% гидролизата лактальбумина/10% сахарозы, 72-74-часового цикла вакуумной сушки при более низком давлении (100 миллиторр): начальная сушка в течение 16 часов при -30ºC и конечная температура на стеллаже 35ºC. Учитывая высокий титр выпускаемой вакцины, её можно использовать в полевых условиях в течение 30 дней