Критерии качества (стерильность, чистота, отсутствие посторонних возбудителей)

Весь посевной материал подлежит тестированию с целью обеспечения его идентичности и подтверждения отсутствия занесенных вирусов, в частности, пестивирусов, таких как вирусы пограничной болезни овец и вирусной диареи КРС, а также отсутствия контаминации бактериями, грибками и/или микоплазмой. Общие процедуры проведения анализов на стерильность или чистоту описаны в главе 1.1.9. Посевной вирус также должен быть безопасен и не должен вызывать никаких клинических реакций у всех пород овец или коз при ведении рекомендованным способом, а также должен стимулировать абсолютный иммунитет к каприпоксвирусу у всех пород овец и коз в течение минимум 1 года. В Разделе С.2.2.4 Тестирование партий готового продукта описаны исследования на безопасность и испытания на иммуногенность.

 

Метод производства

Метод производства подлежит документированию как указано в Кратком описании производства.

 

Процедура

 Вакцинный посевной материал лиофилизируют и хранят в 2мл пробирках при –20°C. Его можно хранить во влажном состоянии при –20°C, однако, будучи влажным, он более стабилен при температурах –70°C или ниже. Вирус культивируют на первичных или вторичных LT или LK клетках шерстных пород овец для получения максимального урожая вируса. Vero клетки можно также использовать с соответствующими адаптивными штаммами.

 Партии вакцин продуцируют на свежеприготовленных монослоях вторичных LT или первичных LK клеток. Пробирку с посевным вирусом ресуспендируют в среде GMEM или в другой пригодной среде и инокулируют на LT или LK монослой, предварительно промытый теплым ФБР, выдерживают для абсорбции в течение 15 минут при 37°C до нанесения дополнительной среды GMEM. Через 4-6 дней наблюдается экстенсивное (80–90%) ЦПД. Культуру исследуют на наличие неспецифичного ЦПД, помутнение среды или изменение рН. Культуру подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию, суспензию удаляют и центрифугируют при 600g в течение 20 минут. Для продуцирования достаточного количества вируса, для производственной партии может потребоваться второй пассаж. Живую вакцину можно продуцировать в роллер-флаконах.

 Процедуру повторяют, урожай, полученный из отдельных пронумерованных флаконов, смешивают отдельно с равным объемом стерильного и охлажденного 5% лактальбумина гидролизата и 10% сахарозой и переносят в отдельно пронумерованные флаконы для хранения при –20°C. Перед хранением 0,2 мл удаляют из каждого флакона для проверки стерильности. Дополнительно 0,2 мл удаляют для проведения титрования вируса; используют 2 мл пула, состоящего из 0,2 мл образца, взятого из 10 флаконов. Записи обо всех процедурах хранят для всех партий вакцин.

 Инактивированные вакцины продуцируют, обычно из неаттенуированных полевых штаммов каприпоксвируса, выращенного на тканевой культуре как описано выше,

инактивируют 0,03% формальдегидом, смешивают с равным объемом гидроокиси алюминия в качестве адъюванта. Формальдегид более не считается пригодным инактивирующим веществом для некоторых вирусных вакцин в связи с тем, что механизм действия не гарантирует абсолютной эффективности при инактивации всех вирусных вакцин. Этот механизм еще не был полностью изучен в отношении каприпоксвирусов.

 

Требования к субстрату и среде

Следует документировать технические условия производства и источники всех компонентов, используемых в технологическом процессе, а также проводить исследование на отсутствие посторонних веществ: бактерий, грибов, микоплазмы и иных вирусов. Подробная процедура тестирования приведена в Главе 1.1.9. Применять антибиотики следует в соответствии с требованиями лицензирующего органа.

 

Технологический контроль

i) Клетки

Клетки получают из семенников или почек здоровых молодых барашков шерстной породы из стада, свободного от заражения скрепи. В процессе культивирования клетки исследуют на наличие признаков ЦПД и нормальную морфологию (преимущественно фибробластов). Как правило, возможно пассирование клеток до десяти раз. При использовании для производства вакцин незараженные контрольные культуры выращивают параллельно и используют как минимум в трех дополнительных пассажах для дальнейшего изучения. Их проверяют на наличие нецитопатических штаммов бычьей вирусной диареи или вирусов пограничной болезни овец иммунофлуоресцентным или иммунопероксидазным методом. По возможности, клетки готовят и скринируют перед производством вакцин и хранят в жидком азоте 1-2 мл аливквоты, содержащие 2 × 107 клеток/мл в стерильном растворе 10% DMSO (диметил сульфид) и 90% ФБС (фетальная бычья сыворотка).

ii) Сыворотка

Бычья сыворотка, используемая в питательной или поддерживающей среде, должна быть свободна от трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ) и антител к каприпоксвирусу и проверена на отсутствие контаминации пестивирусом или иными вирусами, чужеродными бактериями, микоплазмой или грибами.

iii) Среда

Среда подлежит проверке на отсутствие контаминации пестивирусом или иными вирусами, чужеродными бактериями, микоплазмой или грибами.

iv) Вирус

Посевной вирус и готовую вакцину титруют в пробирках для тканевых культур или микротитрационных планшетах. Образцы вакцины исследуют на наличие занесенных вирусов, включая цитопатические и нецитопатические штаммы пестивирусов, и смешивают с высокотитрованной иммунной сывороткой к каприпоксвирусу, которая дала отрицательную реакцию на антитела к пестивирусу, во избежание искажения результатов из-за присутствия интерферирующего вакцинного вируса. Активное вещество вакцины хранят при –20°C или ниже до завершения всех анализов на стерильность и титрований, после чего его лиофилизируют в 1 мл аликвотах в пробирках, рассчитанных на 100 доз. Урожай вакцины, разведенный гидролизатом лактальбумина и сахарозой, должен иметь минимальный титр log10 4.5 TCID50 на мл после лиофилизации, эквивалентный полевой дозе log10 2.5 TCID50. Последующее титрование проводят на пяти произвольно выбранных пробирках лиофилизированного препарата для подтверждения титра.