Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1983 г. Карри Муллис метод анализа геномной ДНК.

Метод ПЦР (специфическая амплификация ДНК) позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен п.о., реже до 1000 – 2000 п.о., используя в качестве матрицы лыбые образцы ДНК, которые содержат амплификационную последовательность.

Необходимым условием для проведения успешной ПЦР, является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК. Т.к. специфический выбор этого участка осуществлют путем гибридизации матричной ДНК с 2 искусственно синтезированными праймерами – олигонуклеотидные последовательности ДНК, длиной обычно 15 – 30 п.о. комплементарными 3^/ - концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК. Т.о. расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

Для проведения амплификации не требуется большого количества матричной ДНК. Успех ПЦР связан с использованием фермента - ДНК – полимеразы, которая устойчива к действию высоких температур.

 Для анализа необходимо:

· ДНК пациента

· праймеры

· ДНК – полимераза

 

Схема проведения ПЦР.

1. Исследуемая 2-нитевая матричная ДНК переводится в 1-нитевую форму путем её нагревания в течение нескольких минут до температуры превышающей 95-98 ^оС.

2. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов:

· гибридизация (отжиг ДНК с праймерами)

· синтез последовательности комплиментарной мРНК

· денатурация образовавшихся 2-нитевых ДНК

При гибридизации, достигаемой за счет ↓t реакционной смеси до 35-50 ^оС, происходит образование 2-нитевого участка ДНК в строго специфичных областях комплиментарных праймерам.

При t^o оптимальной для работы ДНК – полимеразы (60 – 70 ^оС) начинается синтез ДНК в направлении 5^/ - 3^/ с 2-нитевого участка, образуемого праймерами. Затем, при t^o раствора (реакционной смеси) ≈до 80-90 ^оС синтез прекращается и 2-нитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурируется).

В первом цикле олигопраймеры гибридизуются (отжигаются) с исходной матричной ДНК, а затем в последующих циклах с вновь синтезируемыми молекулами ДНК по мере их накопления в растворе.

В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК – полимеразной границы амплифицируемого участка, что определяет размер синтезируемого участка ДНК с точностью до 1 нуклеотида.

Т.о. при каждом цикле происходит 2-кратное увеличение числа синтезируемых копий, выбранных для амплификации участка ДНК. Содержание продуктов амплификации в растворе увеличивается в геометрической последовательности.

Каждая из процедур цикла определяется 2 параметрами:

· t^o реакции

· длительность реакции, которая меняется в диапазоне от 10 секунд до 1-3 минут

Так что полный цикл длится несколько минут. За 25-30 циклов число синтезируемых копий ДНК достигает нескольких миллионов.

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя специальные приборы – термоциклеры (амплификаторы ДНК). Он позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла. В технике исполнения ПЦР очень проста.

 Все компоненты реакции (ДНК, олигопраймеры, смесь дезоксинуклеотитрифосфатов dNTP, термофильная ДНК-полимераза) + специальный буфер, поверх смеси наслаивают вазелиновое масло для предотсращения высыхания. Все это помещают в эпиндорф и ставят в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены t^o  и длительности для каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси может быть 10-50-100 мкл (выбор оптимального режима определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка).

Следует отметить, что реально для каждой ПЦР, в зависимости от типа праймера, длины каждого амплифицируемого фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа ДНК-полимеразы, режимы температур и состав амплифицируемой смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираться эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов или других специфических особенностей ДНК.

Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности нужного амплифицируемого участка.

Для того, чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. Поэтому в качестве источника ДНК могут быть использован любой даже деструктивный биоматериал, сохранивший в своём составе полный набор фрагментов исходной ДНК.

Для амплификации наряду с нормально очищенной ДНК используют высушенные пятна крови, небольшие участки тканей (биопсия, ворсины хориона, гастро-бронхоскопия, луковицы корней волос, культуры клеток, соскобы, длительнофиксированные ткани).

Существуют различные модификации ПЦР, которые используют в зависимости от различных целей проведения реакции и характерных анализов амплификата. Для трудноамплифицируемых участков ДНК, когда ДНК присутствует в следовых количествах – ПЦР проводят в 2 этапа, используя в качестве ДНК на 2 этапе амплификацию или доамплификацию (клонирование – размножение до необходимых участков последовательности ДНК).

Для определенных случаев удобно проводить мультиплекснуб ПЦР, т.е. одновременно амплификацию нескольких участков ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, можно добавлять в реакционную смесь меченые dNTP. Можно наблюдать в УФ-свете путем обычного окрашивания агарозной смеси этидио бромидом.

 

Блот-гибридизация по Саузерленду (гибридизация in situ).

Одним из эффективных методов идентификации определенных участков ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является метод блот-гибридизации.

Суть метода: рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами. Образуются фрагменты ДНК разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллюлоидный фильтр, нейлоновая мембрана). Сам перенос – блотинг осуществляется за счет действия капиллярных сил или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Блот-гибридизация довольно высокочувствительный метод идентификации последовательности ДНК. При длительной экспозиции (несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК – зонда этот метод позволяет выявлять менее чем 0.1 мг ДНК.

При использовании зонда растворами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 100п.о. может быть выявлена в 10 мг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 часов.

Метод позволяет работать с очень короткими олигонуклеотидными последовательностями (min 20 п.о.). Однако требуют хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра.

Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость этой процедуры делают метод дорогостоящим. Этот метод используется для диагностики генных заболеваний.

Сейчас иногда радиоактивные зонды заменяют зондами нитрата серебра. Гибридизация с меченным ДНК – зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот – гибридизации (зависит от конфигурации пятна на фильтре):

· округлое – дот – гибридизация

· продолговатое – слот – гибридизация

 

Методом гибридизации ДНК – зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название нозен – блот. Тогда как вестерн – блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с меченными АТ.

Для проведения гибридизации с ДНК – зондами не требуется предварительно выделить и очистить ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле и фильтрах, не только в растворе, но и на гистологических и хромосомных препаратах – гибридизация in situ.

Вариант метода, при котором в качестве зондов используют ДНК (РНК), меченные флюорохромами, называется FISH – фиш ( флюоресцентная in situ гибридизация ).

Меченый ДНК – зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации хромосом (денатурированные метафазные хромосомы). Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

Важное значение имеет подбор условий – после отмывки не связавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (например, радиоактивная метка) либо проведение соответствующей обработки – биотин, флюоресцин – меченые ДНК – зонды – места локализации последовательностей ДНК, комплиментарных используемому зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных жирных полос на соответствующем участке определенных хромосом.

Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения при определении не только хромосомной принадлежномти, но и внутрихромосомной локализации генов, когда имеются соответствующие ДНК – зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов.

Разрешающая способность FISH – до 50 тыс.п.о. (1/20 величины среднего хромосомного бэнда). Этот метод используют для тканеспечифичного распределения и внутриклеточной локализации мРНК.