Закон единообразия гибридов первого поколения.

Законы Менделя.

В своих работах Мендель использовал гибридологический метод: скрещивание с получением гибридов и анализом результатов расщепления признаков по фенотипу потомков.

 

Особенности:

 

1- статистичность: большое количество материала, т.к. анализ косвенный, необходимо равновероятное соединение всех сортов гамет, равновероятная жизнеспособность зигот, полное проявление признаков

2- аналитичность: анализ от простого к сложному

3- использование альтернативных признаков, т.е. особи для скрещивания четко различаются по фенотипу

4- использование самоопылителей дает возможность убедится в чистоте линий

5- использование плодовитых линий, не вызывает регулярную потерю

6- проведение реципрокных скрещиваний, когда меняется пол обладателя признака, для выявления признаков, сцепленных с полом

7- принцип принудительного перекрестного опыления

Закон единообразия гибридов первого поколения.

 

В первом поколении все потомки были с желтыми горошинами. Тот признак, который проявляется в первом поколении – доминантный, признак, который исчез – рецессивный.

А – желтые горошины (доминантный признак)

а – зеленые горошины (рецессивный признак)

Р: ♀ АА х ♂ аа

F1: Aa – желтые

 

При скрещивании особей, отличающихся по одной паре признаков, в F1 наблюдается единообразие по фенотипу и генотипу.

Закон расщепления.

 

Р: ♀ Аа х ♂ Аа

F1: AA: Aa: aa

  ж  ж з

 

При скрещивании гибридов первого поколения во втором поколении наблюдается расщепление особей по фенотипу 3: 1, по генотипу 1: 2: 1.

Закон независимого наследования.

При анализе дигибридного скрещивания.

 

А – желтые горошины

А – зеленые горошины

В – гладкая кожура

B – морщинистая кожура

 P: ♀ AABB x ♂ aabb

F1: AaBb – желтые гладкие

Р2: ♀ АаВb x ♂ AaBb

F2: 9/16 – желтые гладкие А_В_

3/16 – зеленые гладкие ааВ_

3/16 – желтые морщинистые A_bb

1/16 – зеленые морщинистые ааbb

 

При скрещивании особей, отличающихся по 2 и более парам альтернативных признаков, наследование по каждой паре идет независимо от других.

Промежуточное наследование.

При скрещивании растений ночная красавица с белым и красным венчиком в первом поколении имели розовую окраску венчика. Имеет место неполное доминирование, т.е. подавление одного аллеля другим. При скрещивании гибридов первого поколения во втором поколении расщепление по генотипу и фенотипу совпадают.

Кодоминирование – оба аллеля проявляют себя в гетерозиготном состоянии.

Пр.: наследование групп крови системы MN

 

P: ♀ MM x ♂ NN

F1: MN

Ни один из аллелей не подавляет другой.

 

Аллельные гены – гены, расположенные в гомологичных локусах гомологичных хромосом.

При анализе был обнаружен ряд случаев, когда получающиеся фенотипические соотношения не укладывались в классическую схему.

При скрещивании желтых и черных мышей между собой в первом поколении получались желтые мыши, а во втором поколении получалось соотношение 2: 1, т.е. часть эмбрионов гибнет (АА), желтые Аа – гетерозиготы, гомозиготы гибнут.

 

Было обнаружено, что некоторые признаки могут контролироваться не одним геном, а 2 и более. Характер взаимоотношения неаллельных генов могут быть различными, наиболее изучены:

· комплиментарность

· эпистаз

· полимерия

 

Комплементарность – взаимодействие неаллельных, неэквивалентных или эквивалентных генов, которое сопровождается появлением нового признака. При комплиментарном взаимодействии может быть разное расщепление, в зависимости от того эквивалентные гены или нет, одинаковое или разное фенотипическое проявление.

 

1. окраска перьев у попугаев

А – желтые

а – белые

В – голубые

b - белые

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – зеленая окраска

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - зеленые

3/16 A_bb – желтые

3/16 aaB_ - голубые

1/16 aabb – белые

 

2. форма плода у тыквы (эквивалентные гены)

А – сферическая форма

а – удлиненная форма

В – сферическая форма

b - удлиненная форма

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – дисковидная форма

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - дисковидная форма

3/16 A_bb – сферическая форма

3/16 aaB_ - сферическая форма

1/16 aabb – удлиненная форма

Соотношение: 9:6:1

3. окраска шерсти у грызунов (один аллель имеет собственное фенотипическое проявление, а другой доминантный аллель выполняет регуляторную функцию, не имеет собственного фенотипического проявления)

 

А – черная окраска

а – белая окраска

В – распределение пигмента по волосу

b – белая окраска

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – окраска агути

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - агути

3/16 A_bb – черный

3/16 aaB_ - белый

1/16 aabb – белый

Соотношение: 9: 3: 4

4. доминантные аллели не имеют фенотипического проявления, формирование признака только в присутствии 2 доминантных аллелей

А – пропигмент 1

а – нет синтеза

В – пропигмент 2

b – нет синтеза

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – окраска (есть пигмент)

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - окраска (есть пигмент)

3/16 A_bb –  нет пигмента

3/16 aaB_ - нет пигмента

1/16 aabb – нет пигмента

Соотношение: 9: 7

Биохимические модели комплементарного взаимодействия, предложенные Вагнером и Митчеллом:

· Последовательная модель – последовательность химических реакций при взаимодействии неаллельных генов (окраска у мышей).

 

· Параллельная модель взаимодействия неаллельных генов (окраска попугаев)

Эпистаз – это тип взаимодействия неаллельных генов, когда один ген подавляет действие другого гена. Ген, который подавляет, называется эпистатическим или супрессором, подавляемый ген – гипостатический.

В зависимости от вида гена – супрессора выделяют:

  Доминантный эпистаз

· окраска шерсти у лошадей

А – вороная окраска

а – рыжая окраска

В – ранние поседение (серые)

b – нет поседения

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – серые

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - серые

3/16 A_bb – вороная окраска

3/16 aaB_ - серые

1/16 aabb – рыжая окраска

Соотношение: 12: 3: 1

Может быть 13: 3, когда фенотипическое проявление гена – супрессора совпадает с фенотипическим проявлением одного из аллелей, контролирующих признак

 

· окраска кур

А – пестрая

а – белая

В – супрессор

b – не подавляет

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – белые

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - белые

3/16 A_bb – пестрые

3/16 aaB_ - белые

1/16 aabb – белые

Соотношение: 13: 3

Рецессивный эпистаз – ген – супрессор рецессивен

· окраска плода у тыквы

А – желтые

а – зеленые

В – проявление

b – супрессор

 

Р: ♀ ААbb х ♂ ааВВ

F1: AaBb – желтые

P2: ♀ AaBb x ♂ AaBb

F2: 9/16 A_B_ - желтые

3/16 A_bb – белые

3/16 aaB_ - зеленые

1/16 aabb – белые

Соотношение: 9: 3: 4

· бомбейский феномен – явление, когда на локус имеется более 2 аллелей называется множественным аллелизмом (группы крови). Эволюция – это увеличение разнообразия, увеличение изменчивости → повышение адаптивных возможностей.

 

H – проявление, h – супрессор

 

Р: ♀ I^BI⁰hh  x  ♂ I^AI⁰HH

F1: I^AI^BHh

Предположили, что имеется редкий рецессивный ген – супрессор, который подавляет синтез антигенов А и В.

Модель эпистаза по Вагнеру и Митчеллу: значение генов – супрессоров в том, что они обуславливают развитие нормального фенотипа не смотря на присутствие неаллельного мутантного гена.

                      

Взаимодействие с продуктом мутантного гена восстанавливает дикий фенотип

Включение запасного метаболического пути:

Ген – супрессор, действуя на другой субстрат, может приводить к формированию дикого фенотипа. Фермент работает на другом субстрате.

 

 

Полимерия – это взаимодействие неаллельных эквивалентных генов, действие которых может взаимно усиливаться.

Пр.: пигментация кожи у человека контролируется 2 парами эквивалентных неаллельных генов, действие которых суммируется кумулятивная полимерия

 

А₁, А₂ – выработка пигмента

а₁, а₂ – нет пигмента

Р: ♀ А₁А₁А₂А₂ х ♂ а₁а₁а₂а₂  

F1: А₁a₁А₂a₂

P2: ♀ А₁a₁А₂a₂ x ♂ А₁a₁А₂a₂

F2: 1/16 А₁A₁А₂A₂ – негр

   4/16 А₁A₁А₂a₂ + А₁a₁А₂A₂ – темный мулат (3 доминантных аллеля)

   6/16 А₁a₁А₂a₂ + А₁А₁а₂a₂ + а₁a₁А₂А₂ – мулат (2 доминантных аллеля)

   4/16 А₁a₁а₂a₂ + а₁a₁А₂a₂ – светлый мулат (1 доминантный аллель)

   1/16 а₁а₁а₂а₂ – белый (рецессивные аллели)

 

 

Признак варьирует от дозы гена, совместное действие аллелей усиливает проявление признака. Так наследуются преимущественно количественные признаки, чем больше генов контролирует признак, тем сложнее выделить отдельные фенотипические классы. Начиная с 5 пар, формируется непрерывный фенотипический ряд. Количественные признаки определяются по типу кумулятивной, накопительной полимерии.

 

Существуют качественные признаки, которые тоже определяются полимерными генами, но в этом случае признак не варьирует от дозы гена и для полного развития признака достаточно одного аллеля.

Пр.: форма плода у пастушьей сумки (некумулятивная полимерия).

 

А₁, А₂ – треугольная

а₁, а₂ – овальная

Р: ♀ А₁А₁А₂А₂ х ♂ а₁а₁а₂а₂  

F1: А₁a₁А₂a₂

P2: ♀ А₁a₁А₂a₂ x ♂ А₁a₁А₂a₂

F2: 1/16 А₁A₁А₂A₂ – треугольная

   4/16 А₁A₁А₂a₂ + А₁a₁А₂A₂ – треугольная       

   6/16 А₁a₁А₂a₂ + А₁А₁а₂a₂ + а₁a₁А₂А₂ – треугольная

   4/16 А₁a₁а₂a₂ + а₁a₁А₂a₂ – треугольная

   1/16 а₁а₁а₂а₂ – овальная

Соотношение: 15: 1

Гипотезы возникновения полимерии:

1- происхождение полимерии возможно при скрещивании 2 близких форм, имеющих одинаковые доминантные гены с одним и тем же действием. При таком скрещивании у гибрида могло произойти удвоение набора хромосом.

2- путем различных хромосомных перестроек – неравный кроссинговер

 

Биологическое значение некумулятивной полимерии – это резервирование изменчивости. Данные, полученные в результате изучения наследования количественных признаков, показали, что большая часть признаков организма обусловлены множественными генами, анализ их весьма сложен, т.к.

· число полимерных генов может быть различным

· сила действия и значение гена может быть специфично

· каждый из генов может иметь разную степень доминирования

 

 

Гены-модификаторы

- гены, которые усиливают или ослабляют проявления других генов. В широком смысле все гены являются модификаторами, т.к. изменение одного влияет на другие. В узком понимании - вызывает переходные формы, влияет на степень выраженности. Могут иметь собственное проявление, а могут проявляться в присутствии главного гена.

ВвМм, ВвММ – брахидактилия выражена

Ввмм – брахидактилия не выражена

 

Генетический фон – способность одного и того же гена, по-разному проявлять свое действие в разных системах генотипа.

 

Мультифакториальность – зависимость в формировании признака от многих генов и от средовых факторов.

В случае, когда признак контролируется определенным геном, дающим общую возможность развития данного признака, он называется главным геном. Развитие особи идет на базе целостной генетической программы, определенной всей совокупностью генов, присущих данной особи.

Все эти гены взаимодействуют друг с другом, и для обозначения системы гармонично взаимодействующих генов введено понятие о генном балансе.

Идея о генном балансе, для N развития особи необходимы 3 параметра:

1. особь обладает полным набором генов (док-во летальность по нехваткам)

2. действие генов должно быть сбалансировано за счет определенных количественных соотношений. Особь, у которой гаплоидный набор – жизнеспособна, но снижены показатели.

2n – более хилая

2n-1 – Let

3. действие генов должно быть четко синхронизировано, т.е. продукты должны    нарабатываться в четко определенное время

 

Карты хромосом.

 

Частота кроссинговера между 2 сцепленными генами представляет собой величину постоянную для данной конкретной пары генов. Для других пар генов она будет другой, но тоже вполне определенной.

На основании этого Стертевант предположил, что гены в хромосоме расположены линейно, частота кроссинговера показывает относительное расстояние между генами. Поэтому было предложено строить линейные карты хромосом.

АВ = 15

BC = 26

AC = 41

Разница 6% возникает за счет двойного кроссинговера, так как каждый четный кроссинговер аннулирует нечетный. На протяженных участках учитывать такой кроссинговер очень трудно, поэтому чем дальше гены стоят друг от друга, тем более вероятно прохождение 2 кроссинговера, тем менее точным получается расстояние между генами, поэтому при составлении ген. карт расстояние между 2 генами определяют не путем подсчета частоты кроссинговера между этими генами, а путем сложения расстояний между близко расположенными генами, находящихся между ними.

AB + BC + CD + DE + EF

Расстояние между генами принято выражать в % кроссинговера или сантиморган.

 

 

                                              Интерференция (1916 г.Мюллер)

Исследование двойных и множественных кроссинговеров показало, что прошедший кроссинговер затрудняет осуществление кроссинговера в близлежащих участках.

Частота кроссинговера на двух близлежащих участках равна произведению кроссинговера на общем участке:

ABC      AB   BC                 = > AC = 0,18 *0,26*100% = 5,2%

    18%  26%                          В опыте AC = 3%

 

Количественно интерференцию выражают, как отношение наблюдаемого числа двойных кроссинговеров к числу теоретически ожидаемых:

 

      

если С = 1, нет влияния одного кроссинговера на др.

если С > 1, «-» интерференция – один кроссинговер стимулирует др.

если С <1, «+» интерференция – один кроссинговер тормозит др.

 

Причины интерференции точно неизвестны. Долго считалось, что это связанно с упругостью хромосом; в настоящее время наиболее вероятной причиной является конкуренция за ферменты.

 

Ген. карты показывают относительное расположение генов в хромосоме, но при сопоставлении их с цитологическими, оказывается, что соответствие достаточно высоко.

Цитологические карты строят, используя либо митотические, либо политенные (многонитчатые, которые образуются у некоторых видов в результате множественных репликаций, за которыми не следует деление. Есть участки с разной спирализацией, которые располагаются в виде дисков. Расположение и количество дисков хорошо известны) хромосомы.

 

                                

Принципы построения цитологических карт:

Мух облучают, возникают делеции (утрата участков хромосом).

P₁: ♀ W⁺                                W⁺ → W⁺    W^-  * ♂ W              - анализ политенных хромосом у

                                                                                                             личинок от этого скрещивания.

                          но всё равно кр.глаза

 

 

F₁: W⁺      W     W^-                                W                       - гомологичные политенные хромосомы, и в

случае если оба аллеля на месте – формируют пары

       белые глаза

 

 

 

Если участок хромосомы утрачен:

♀        

 

♂

 

При обнаружении участка асинапса, сравнивают с маркёром и делают вывод о физическом расположении генов хромосом. Полного соответствия между генетическими и цитологическими картами - нет. Особенно это заметно в участках около центромеры; на генетических картах хромосомы лежат значительно кучнее, чем на цитологических. Одно из возможных объяснений связанно с различным состоянием хроматина.

Гетерохроматин - генетически малоактивен, в участках повышенной спирализации кроссинговер проходит редко.

Эухроматин – кроссинговер проходит более часто.

 

 

 

Огромный вклад в изучение ген.карт внёс Макьюсик, занимаясь ими всю свою сознательную жизнь.

 

На частоту кроссинговера могут влиять:

- возраст организма

- физиологическое состояние клетки

- генотип

- факторы внешней среды

Пр.: у кукурузы открыты гены, контролирующие синапсис

 

 

Структура генов.

Вопрос о природе аллелизма. Сравнивая аллели гетерозигот: ген представляет собой элементарную неделимую структуру, которая при мутациях изменяется целиком, т.е. ген является единицей мутации и рекомбинации.

 

Ступенчатый аллелизм.

В 1929 – 1930 гг. Серебровский и Дубинин исследовали серию множественных аллелей, которые контролировали наличие и отсутствие щетинок на различных полях у дрозофил. Scute – каждая линия характеризовалась отсутствием определенных щетинок, локус локализован в Х-хромосоме.

 Р: ♀ Х ♂

F1:  ;

Sc1 – отсутствие щетинок на участках А, В, С

Sc2 – отсутствие щетинок на участках В, С, D

 

Компаунд – гетерозигота по 2 мутантным аллелям.

Оказалось, что у компаундов отсутствуют щетинки на полях В и С. Проведя скрещивания с 13 различными линиями, они наблюдали одну и ту же закономерность как бы частичного восстановления признаков у компаундов.

Гипотеза: ген, как основа (базиген) состоит из частей, которые могут мутировать (трансгены). Т.е. ген дробим и мутирует не целиком, а по трансгенам, следовательно он не является единицей мутации.

 

Аллели – это разные состояния одного и того же гены, аллельными называют мутации, которые затрагивают один и тот же ген.

Как определить аллельны или не аллельны какие–либо 2 независимо возникшие мутации?

 

Функциональный критерий (Морган). Основан на том, что при скрещивании 2 мутантов, несущих изменения разных генов, возникает гибрид в F1, имеющий дикий фенотип.

 

Р: ♀  Х ♂

 

F1:  => признаки не аллельны

 

Р: ♀ а₁а₁ х ♂ а₂а₂

слепые  слепые

 

F1: a₁ a₂ – зрячие => признаки аллельны

 

Морган предложил этот критерий для не сцепленных генов. Льюис предложил цис -, транс- испытание, где анализировались сцепленные гены.

 

Р: ♀   Х ♂  → → не аллельные признаки

      N        мутант     N

Р: ♀   Х ♂  →  → признаки аллельные

 

Цис-испытание оказалось неинформативным, т.к. невозможно по результатам скрещивания отличить сцепленные аллельные признаки от неаллельных.

Транс-испытание (родитель имеет оба генотипических изменения).

Р: ♀   Х ♂ → → аллельные

    слепые                         зрячие

 

Расщепление – расхождение аллелей в потомстве гетерозигот.

Вывод Льюиса: неаллельные гены рекомбинируют, сцепление не влияет на функциональный критерий.

 

Рекомбинационный критерий (Морган). Основан на том, что аллельные гены расщепляются (могут и рекомбинировать), поэтому нужно исключить аллельную рекомбинацию.

 

Р: ♀ Аа х ♂ Аа

G: А а     А а

F1: AA, Aa, Aa, aa.

 

Для использования рекомбинационного критерия необходимо, чтобы один родитель обладал 2 генотипическими изменениями, а другой не имел ни одного.

 

               

Гены аллельны, т.к. наблюдается                   Гены не аллельны.

расщепление.

 

Рекомбинационный критерий может давать ошибку 10^-6, которая объясняется внутригенным кроссинговером.

 

Грин, Льюис, Оливер исследовали дрозофил Scute. Они проводили возвратное скрещивание компаундов.

х   →

Должны получаться только мутантные формы, но когда они исследовали выборку до 10000 и более мух, то они обнаружили, что в результате таких скрещиваний появляются потомки дикого типа. Это объясняется, если допустить возможность существования внутригенного кроссинговера.

 

Стали говорить о псевдоаллелизме, но когда обнаружили это явление у других видов, то согласились, что ген не является единицей рекомбинации.

Функциональный критерий тоже может давать ошибки, причина – комплиментация аллельных генов. Особенность межаллельной комплиментации – не все аллели, а только сочетания некоторых из них могут образовывать зиготу дикого типа. Это связано с тем, что каждый мутантный аллель имеет свой участок повреждения.

 → N

 → N

 → мутант

Генные продукты (белки) в цитоплазме могут взаимодействовать.

 

 

Т.о. в результате исследований получили:

1. ген дробим, состоит из отдельных частей, расположенных в них в отдельном порядке и они могут независимо изменяться при мутациях. Единица мутации - мутон (нуклеотид).

2. ген не является единицей рекомбинации, т.к. кроссинговер может происходить внутри сложного гена. Единица рекомбинации – рекон.

3. ген является единицей функции, но действие гена в целом обусловлено интеграцией его отдельных частей

 

Молекулярная биология.

Схема проведения ПЦР.

1. Исследуемая 2-нитевая матричная ДНК переводится в 1-нитевую форму путем её нагревания в течение нескольких минут до температуры превышающей 95-98 ^оС.

2. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов:

· гибридизация (отжиг ДНК с праймерами)

· синтез последовательности комплиментарной мРНК

· денатурация образовавшихся 2-нитевых ДНК

При гибридизации, достигаемой за счет ↓t реакционной смеси до 35-50 ^оС, происходит образование 2-нитевого участка ДНК в строго специфичных областях комплиментарных праймерам.

При t^o оптимальной для работы ДНК – полимеразы (60 – 70 ^оС) начинается синтез ДНК в направлении 5^/ - 3^/ с 2-нитевого участка, образуемого праймерами. Затем, при t^o раствора (реакционной смеси) ≈до 80-90 ^оС синтез прекращается и 2-нитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурируется).

В первом цикле олигопраймеры гибридизуются (отжигаются) с исходной матричной ДНК, а затем в последующих циклах с вновь синтезируемыми молекулами ДНК по мере их накопления в растворе.

В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК – полимеразной границы амплифицируемого участка, что определяет размер синтезируемого участка ДНК с точностью до 1 нуклеотида.

Т.о. при каждом цикле происходит 2-кратное увеличение числа синтезируемых копий, выбранных для амплификации участка ДНК. Содержание продуктов амплификации в растворе увеличивается в геометрической последовательности.

Каждая из процедур цикла определяется 2 параметрами:

· t^o реакции

· длительность реакции, которая меняется в диапазоне от 10 секунд до 1-3 минут

Так что полный цикл длится несколько минут. За 25-30 циклов число синтезируемых копий ДНК достигает нескольких миллионов.

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя специальные приборы – термоциклеры (амплификаторы ДНК). Он позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла. В технике исполнения ПЦР очень проста.

 Все компоненты реакции (ДНК, олигопраймеры, смесь дезоксинуклеотитрифосфатов dNTP, термофильная ДНК-полимераза) + специальный буфер, поверх смеси наслаивают вазелиновое масло для предотсращения высыхания. Все это помещают в эпиндорф и ставят в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены t^o  и длительности для каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси может быть 10-50-100 мкл (выбор оптимального режима определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка).

Следует отметить, что реально для каждой ПЦР, в зависимости от типа праймера, длины каждого амплифицируемого фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа ДНК-полимеразы, режимы температур и состав амплифицируемой смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираться эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов или других специфических особенностей ДНК.

Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности нужного амплифицируемого участка.

Для того, чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. Поэтому в качестве источника ДНК могут быть использован любой даже деструктивный биоматериал, сохранивший в своём составе полный набор фрагментов исходной ДНК.

Для амплификации наряду с нормально очищенной ДНК используют высушенные пятна крови, небольшие участки тканей (биопсия, ворсины хориона, гастро-бронхоскопия, луковицы корней волос, культуры клеток, соскобы, длительнофиксированные ткани).

Существуют различные модификации ПЦР, которые используют в зависимости от различных целей проведения реакции и характерных анализов амплификата. Для трудноамплифицируемых участков ДНК, когда ДНК присутствует в следовых количествах – ПЦР проводят в 2 этапа, используя в качестве ДНК на 2 этапе амплификацию или доамплификацию (клонирование – размножение до необходимых участков последовательности ДНК).

Для определенных случаев удобно проводить мультиплекснуб ПЦР, т.е. одновременно амплификацию нескольких участков ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, можно добавлять в реакционную смесь меченые dNTP. Можно наблюдать в УФ-свете путем обычного окрашивания агарозной смеси этидио бромидом.

 

Блот-гибридизация по Саузерленду (гибридизация in situ).

Одним из эффективных методов идентификации определенных участков ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является метод блот-гибридизации.

Суть метода: рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами. Образуются фрагменты ДНК разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллюлоидный фильтр, нейлоновая мембрана). Сам перенос – блотинг осуществляется за счет действия капиллярных сил или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Блот-гибридизация довольно высокочувствительный метод идентификации последовательности ДНК. При длительной экспозиции (несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК – зонда этот метод позволяет выявлять менее чем 0.1 мг ДНК.

При использовании зонда растворами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 100п.о. может быть выявлена в 10 мг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 часов.

Метод позволяет работать с очень короткими олигонуклеотидными последовательностями (min 20 п.о.). Однако требуют хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра.

Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость этой процедуры делают метод дорогостоящим. Этот метод используется для диагностики генных заболеваний.

Сейчас иногда радиоактивные зонды заменяют зондами нитрата серебра. Гибридизация с меченным ДНК – зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот – гибридизации (зависит от конфигурации пятна на фильтре):

· округлое – дот – гибридизация

· продолговатое – слот – гибридизация

 

Методом гибридизации ДНК – зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название нозен – блот. Тогда как вестерн – блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с меченными АТ.

Для проведения гибридизации с ДНК – зондами не требуется предварительно выделить и очистить ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле и фильтрах, не только в растворе, но и на гистологических и хромосомных препаратах – гибридизация in situ.

Вариант метода, при котором в качестве зондов используют ДНК (РНК), меченные флюорохромами, называется FISH – фиш ( флюоресцентная in situ гибридизация ).

Меченый ДНК – зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации хромосом (денатурированные метафазные хромосомы). Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

Важное значение имеет подбор условий – после отмывки не связавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (например, радиоактивная метка) либо проведение соответствующей обработки – биотин, флюоресцин – меченые ДНК – зонды – места локализации последовательностей ДНК, комплиментарных используемому зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных жирных полос на соответствующем участке определенных хромосом.

Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения при определении не только хромосомной принадлежномти, но и внутрихромосомной локализации генов, когда имеются соответствующие ДНК – зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов.

Разрешающая способность FISH – до 50 тыс.п.о. (1/20 величины среднего хромосомного бэнда). Этот метод используют для тканеспечифичного распределения и внутриклеточной локализации мРНК.

 

Плазмиды.

Плазмиды – небольшие двуцепочечные молекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе копий в бактериальной клетке.

Открытие плазмид связано с изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Оказалось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие клетке устойчивость к антибиотикам и потеря чувствительности бактерий к их действию как раз и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются плазмиды с сообщающей генетическую информацию.

Плазмиды имеют автономную систему репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне (от 1 до нескольких сотен плазмидных генов на клетку).

Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клетке в большом