Хроматографічні методи аналізу

Хроматографічний метод - це метод поділу й аналізу сумішей речовин, заснований на різному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, - рухливої й нерухливої.

При контакті з поверхнею нерухливої фази (НФ) компоненти суміші розподіляються між рухливою (ПФ) і нерухливої фазами відповідно до їх властивостей (адсорбованістю, розчинністю або ін.). Установлюється динамічна рівновага, внаслідок чого молекули поділюваної суміші частина часу перебувають у НФ, а частина - у ПФ. Різні речовини мають різну спорідненість до рухливої й нерухливої фаз. Речовина, сильніше взаємодіюче з нерухливою фазою, буде повільніше рухатися через хроматографічну систему в порівнянні з речовиною, слабкіше взаємодіючим із цією фазою.

Якщо НФ – рідина й аналізована речовина здатна в ній розчинятися, то воно розподіляється між рухливою й нерухливою фазами. Така хроматографія називається розподільної. У тім же випадку, коли НФ – тверда речовина, здатне адсорбувати (поглинати своєю поверхнею) певну речовину, хроматографію називають адсорбційною.

Залежно від способу розміщення НФ розрізняють колончату й тонкошарову хроматографію.

У колончатою хроматографії НФ поміщають у хроматографічну колонку, що представляє собою трубку певної довжини й внутрішнього діаметра.  

У тонкошаровій хроматографії (ТСХ) шар НФ наносять на інертну підкладенку.

З режимів уведення проби найбільш зручний елюентний, коли пробу вводять у потік ПФ (елюента), сполука якого до й після уведення проби залишається незмінним. У процесі руху по стовпчику компонента суміші розділяються на зони, які по черзі виходять зі стовпчика, розділені зонами чистого елюента.

Хроматографічний процес характеризується залежністю концентрації речовини (інтенсивності сигналу) від часу хроматографування (мал.2.8) 

Розходження в часах утримання компонентів характеризує селективність системи (:

a = .

Час утримання - характеристика кожної речовини й тому використовується для якісного аналізу.

Вимір концентрації за допомогою хроматографічних методів засновано на пропорційності між кількістю речовини в зоні й висотою або площею хроматографічного піка (вірніше й точніше – площею).

Для обчислення концентрації речовини в пробі можна використовувати метод абсолютного калібрування, метод внутрішнього стандарту, метод простого нормування й метод нормування з каліброваними коефіцієнтами.

У методі абсолютного калібрування експериментально визначають залежність висоти або площі піка від концентрації речовини й будують градирувальні графіки. Потім визначають ті ж характеристики піків в аналізованій суміші й за графіком знаходять концентрацію аналізованої речовини.

    

Метод внутрішнього стандарту заснований на введенні в аналізовану суміш точно відомої кількості стандартної речовини. У якості стандартного вибирають речовина, близьке по фізико-хімічних властивостях до компонентів суміші, але не що обов'язково є її компонентом. Після хроматографування вимірюють параметри піка аналізованого компонента й стандартної речовини. Якщо стандартна речовина не входить до складу аналізованої суміші, масову частку компонента (%) розраховують по формулі

w _i = 100×r,

де П_i  і П_ст – параметри піків аналізованого компонента й стандарту відповідно; r – відношення маси внутрішнього стандарту до маси проби.

При використанні методу простого нормування приймають суму яких-небудь параметрів піків, наприклад суму висот всіх піків або суму їхніх площ за 100 %. Тоді відношення висоти або площі окремого піка до суми висот або площ, помножене на 100, буде характеризувати масову частку (%) компонента в суміші. Такий метод припускає існування однакової залежності величини вимірюваного параметра від концентрації для всіх компонентів суміші.

У методі нормування з каліброваними коефіцієнтами за 100 % приймається сума параметрів піків з урахуванням чутливості детектора. Розходження в чутливості детектора враховується за допомогою поправочних коефіцієнтів для кожного компонента. Один з переважних компонентів суміші вважають порівняльним, і поправочний коефіцієнт для нього приймають рівним одиниці. Калібровані коефіцієнти розраховують по формулі

К_i = ,

де П_СТ – параметр піка (висота, площа) стандартної речовини; П_i - параметр піка обумовленого компонента; З – концентрація.

За 100 % приймається сума виправлених параметрів K_iП_i , і результат аналізу розраховується так само, як і в методі простого нормування.

 

Лекція 6.

Світлова мікроскопія

 

Устрій світлового мікроскопа. Типи й класи світлових мікроскопів. Оптичні системи мікроскопа та їх характеристики. Процедури настроювання й обслуговування мікроскопів. Фіксація та мікротомія біологічного матеріалу. Типи мікротомів. Методи фарбування тканин. Гістохімічні барвники для фарбування базо- та оксифільних структур. Мікроскопічні методи імуногістохімічного аналізу. Техніка приготування мікротомних препаратів. Темнопольна мікроскопія. Фазово-контрастна мікроскопія. Диференціальний інтерференційний контраст (DIC). Поляризаційна мікроскопія. Стереомікроскопія. Мікроскопія у відбитому світлі. Фотодокументація матеріалів. Програмне забезпечення для обробки й аналізу цифрового зображення.

Лекція 7

Люмінесцентна мікроскопія

Фізика флуоресценції та його використання в аналітичних дослідженнях. Флуоресцентна мікроскопія. Специфічні флуорохроми та їх використання в мікроскопії. Методи FISH і МFISH гібридизації. Ультрафіолетова мікроскопія. Конфокальна мікроскопія. Колоколізаційний аналіз багатокольорової флуоресценції. Довготривалі 3D і 4D дослідження в глибоких шарах зразків в умовах in vivo. Відображення іонних процесів в живих клітинах (FRET-, FRAP-, FLIP- аналізи молекул), фотоактивація і фотоконверсія.

Лекція 8

Електронна мікроскопія

Принципи роботи електронного мікроскопу. Трансмісійні та скануючи мікроскопи. Конструкція електронних мікроскопів. Фіксація та пробопідготовка матеріалів. Негативне контрастування зразків. Ультрамікротомія. Фотодокументація та аналіз отриманих результатів.

Лекція 9