C тановления учения о антибиотиках. Общие свойства антибиотиков

Классификация антибиотиков

Несколько принципов: по происхождению, по механизму действия, по спектру биологического действия, по химическому строению.

 

Классификация по биологическому происхождению

1. Антибиотики, которые вырабатываются микроорганизмами, которые относятся к истинным бактериям (без антиномицетов и цианобактерий)

а) образуемые p. Pseudomonas (пиоцианин)

б) образуемые р. Micrococcus, p. Streptococcus, p. Proteus, p. Escherichia (колиформин, низин)

в) образуемые p Bacillus (субтилин, полимиксин)

2. Антибиотики, которые образуются микроорганизмами, относящимися к порядку Actinomycetalis:

а) p. Streptomyces (стрептомицин, тетрациклины, эритромицин, новобиоцин)

б) p. Nocardia

в) p. Actinomadura

г) p. Micromonospora (гентамицин)

3. Антибиотики, образуемые цианобактериями (малинголид)

4. Антибиотики, образуемые несовершенными грибами (пенициллин, гризиосульфин, цефалоспорины)

5. Антибиотики, образуемые грибами-базидиомицетами и аскомицетами (термофилин)

6. Антибиотики, образуемые лишайниками, водорослями и низшими растениями (бинан, хлорелин)

7. Антибиотики, образуемые высшими растениями (аллицин, рафанин)

8. Антибиотики животного происхождения (лизоцим, интерферон, акмулин, крунин)

 

Классификация антибиотиков по химическому строению

Выделено и описано более 20 тысяч различных антибиотических препаратов, но в медицине используются мало.

В химическом отношении это очень гетерогенная группа, молекулярная масса от 150 до 5000 Да, встречаются практически все известные функциональные химические группы.

Механизмы действия антибиотиков

Характер и механизм действия антибиотиков различен и зависит от химической природы, концентрации препарата и вида микроорганизма, на который действует данный антибиотик.

Прежде всего, каждый антибиотик характеризуется своим спектром действия. Под спектром действия понимают совокупность микроорганизмов или клеток, на которые действуют антибиотики. Существующее определение современно.

 

Антибиотики – ингибиторы нуклеиновых кислот

Антибиотики – ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот – пуринов и пиримидинов: очень малочисленная, почти не используется в медицине.

Антибиотики – ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот делятся на:

- ингибиторы матричных функций ДНК

- ингибиторы ферментов (ДНК и РНК-полимераз)

Ингибиторы матричных функций ДНК нарушает синтез ДНК за счет 2 возможных механизмов:

1) одна группа блокирует матрицу ДНК, образуя с ней неактивный комплекс, в результате чего нарушается процесс считывания генетического кода

2) нарушает структуру и ДНК, и РНК за счет разрыва цепей или выщепления оснований, за счет чего эти нуклеиновые кислоты также теряют функции.

Эти антибиотики используются в основном как противоопухолевые: дауномицин, актиномицины и другие.

Ингибиторы полимераз обладают избирательностью (либо эу-, либо про-) (РНК или ДНК), оказывают бактериостатическое действие.

Новобиоцин – его мишень – фермент гераза (разрывает водородные связи между цепями ДНК и приводит к образованию репликативной вилки).

 

Антибиотики – ингибиторы энергетического метаболизма и окислительного фосфорилирования

Относят антибиотики, которые нарушают активность ферментов дыхательной цепи, а также антибиотики, влияющие на митохондриальную и бактериальную АТФазу (разобщают окислительное фосфорилирование).

Валиномицин разобщает окислительное фосфорилирование за счет нарушения проводимости ЦПМ для ионов водорода.

Олигомицины ингибируют митохондриальную АТФазу.

Антимицин является мощным ингибитором сукцинатдегидрогеназы.

 

Плазмиды и эписомы

По химической природе – двухцепочечная ДНК, которая содержит около 100 генов. Встречаются мелкие и крупные плазмиды, они встречаются в нескольких копиях на хромосому (чем мельче плазмида, тем больше копий).

Существует три вида плазмид: линейные, кольцевые структуры с ковалентно замкнутыми концами и релаксированые формы плазмид (одна цепь ковалентно замкнутая, а другая имеет один или несколько разрывов).

Характерны следующие свойства: находятся вне хромосомы клетки-хозяина, имеет свой собственный репликон (реплицируется автономно от хромосомы хозяина), передаются между клетками посредством определенных механизмов (коньюгация, трансдукция), а также могут быть самотрансферабельными (могут обеспечивать свой собственный перенос). Плазмиды, которые способны встраиваться в хромосому хозяина, называют эписомами. Они имеют собственный репликон, но во встроенном состоянии эписомы реплицируются синхронно с бактериальной хромосомой. Встраивание происходит только в определенные участки ДНК (строго специфичные локусы). В отличие от плазмид, эписомы могут выполнять не только кодированную функцию, но могут выполнять и регуляторную функцию. Если эписома встраивается в дефектный геном, который не может реплицироваться, то репликон эписомы может быть инициатором репликации ДНК.

Встроенная плазмида может переходить в автономное состояние, и это связано с факторами внешней среды или внутриклеточными факторами.

 

Классификация плазмид:

1. По способности к трансмиссии (коньюгативные – обеспечивают свой собственный перенос и способны переносить неконьюгативные плазмиды; неконьюгативные плазмиды – не способны самостоятельно переноситься, но могут переноситься трансмиссивными факторами – коньюгативными плазмидами и бактериофагами).

2. Деление плазмид по типу несовместимости. При одном типе несовместимости одна плазмида подавляет репликацию другой. Это связано с тем, что у плазмид, принадлежащих к одной группе несовместимости, имеется один и тот же участок на цитоплазматической мембране, который инициирует репликацию плазмиды.

3. По фенотипу (проявление плазмиды): R-факторы (резистентности), f-плазмиды и ее варианты, криптические плазмиды (единственные, которые фенотипически не проявляются), пеницилиназные плазмиды стафилококков и Col-факторы (плазмиды бактериоциногении). В антибиотикорезистентности принимают участие только R-плазмиды и пеницилиназные плазмиды.

 

R-плазмиды

Плазмиды резистентности к антибиотикам, ядам и токсическим продуктам; к лекарственным препаратам.

По химичиской природе – двухцепочечные ДНК, которые могут находиться в нескольких формах (линейная, кольцевая, релаксированная). Среди этих типов есть трансмиссивные коньюгативные (обеспечивают свой перенос, самотрансферабельные), а также плазмиды неконьюгативные (передаются посредством коньюгативных факторов – плазмид, вирусов, ДНК).

Среди R-плазмид встречаются плазмиды как в широком смысле, так и эписомы – встраиваются в ДНК генома клетки.

Имеют сложное строение, состоят из двух частей:

1) RTF-фактор – компонент, который обеспечивает перенос плазмиды и этот фактор обладает собственным репликоном (обеспечивает себе репликацию), но не имеет фенотипического проявления – нет кодирующей функции, нет резистентности

2) один или несколько последовательных соединений r-детерминант – собственный репликон, могут реплицироваться, не в состоянии предаваться без RTF-фактора, не могут себя переносить – их кодирующая функция – резистентность к различным веществам, тип устойчивости – ферменты, разрушают или диссоциируют.

RTF – больше, чем одна r-детерминанта. Разная у ДНК плавучая плотность и разное содержание ГЦ-оснований. Разное эволюционное происхождение.

R-плазмиды могут самостоятельно диссоциировать на независимо существующие RTF и отдельные детерминанты (самостоятельно реплицируются).

Стабильность комплекса зависит от самого r-фактора (от его природы) и от клетки-хазяина. Многие крупные R-плазмиды ведут себя как f-(половые) плазмиды и способны детерминировать образование R-пилей.

R-плазмиды объединяются по типам несовместимости; в пределах одного класса несовместимости репликация одной плазмиды подавляется другой группой плазмид. Многие факторы можно подразделить на классы несовместимости.

Плазмиды, относящиеся к одной группе несовместимости, детерминируют одинаковые в химическом отношении половые ворсинки и их ДНК содержат гомологичные последовательности оснований.

R-плазмиды могут сочетать в себе устойчивость сразу к нескольким химиотерапевтическим препаратам.

 

 

Пенициллиназные плазмиды

У стафилококков (R-плазмиды у стафилококков кодируют только синтез пенициллиназ).

Они кодируют устойчивость за счет синтеза пенициллиназ (b-лактамаз).

В зависимости от типа пенициллиназ, которые кодируют эти плазмиды, они – a, b, g … - среди них есть плазмиды, есть в встроенном состоянии и эписомы.

Характерные – неконьюгативные, могут переноситься посредством фагов или коньюгативных плазмид.

 

Транспозоны

Гораздо меньше, 2-20 генов, как и некоторые плазмиды – инф., необходимые для транспозиции (обеспечивают свой перенос), выполняют кодирующую функцию (фенотипическое проявление), встраиваются в любые генетические элементы – репликаторная функция.

Могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы ДНК и не содержат собственного репликона – не способны в этом состоянии к репликации.

Реплицируются тогда, когда находятся в структуре бактериальной хромосомы или другого генетического материала, которые способны к репликации (плазмиды).

В отличии от плазмид (эписом), которые могут встраиваться в определенные участки в бактериальной хромосоме (один или несколько, но определенные), транспозоны встраиваются в любой участок бактериальног огенома или другого репликона. Легко встраиваются в любой репликон.

От одного репликона – в другой: важное свойство транспозонов. Легко отличить – на концах специфические маркеры (особые структуры).

Встречаются у всех представителей живого мира, включая человека.

Являются генными мутаторами.

Генетическая рекомбинация

Огромную роль в передаче лекарственной устойчивости в природе играют генетические рекомбинации бактерий.

Под рекомбинацией понимают внесение части генетического материала одного из родительского штамма (донора) к другому родительскому штамму (реципиенту), образованный в результате этого рекомбинант имеет признаки обоих родителей, при этом основной набор генов реципиента и определенная часть генов донора.

Выделяют три механизма генетической рекомбинации:

1) трансформация – это процесс образования рекомбинанта в результате обработки клеток реципиента молекулами ДНК, выделенными из клеток донора. При трансформации короткие фрагменты двухцепочечной ДНК, которые высвобождаются от клеток донора, собрируются на поверхности клетки, но внутрь попадает одна цепь ДНК из этого фрагмента, а другая деградирует. В природе есть – лекарственная устойчивость.

Разновидность – трансфекция (процесс, при котором в качестве донора ДНК используется вирус.

2) коньюгация – это обмен генетическим материалом в результате прямого скрещивания бактериальных фрагментов, которые переносятся из клетки в клетку. Может быть большим (даже практически все), но внутрь клетки только одноцепочечная ДНК.

3) трансдукция – процесс передачи генетического материала от клетки в клетку посредством бактериофага (умеренный – может встраиватся в геном бактериальной клетки).

При трансдукции небольшие фрагменты двухцепочечной ДНК передаются от клетки донора к клетке реципиента фаговой частицой.

 

Идентификация продуцента

Достаточно сложная задача. Для идентификации нужно изучить очень много признаков.

Первая группа – визуальные:

- морфологические (форма колонии, консистенция, размеры, форма клеток, наличие спор, спороносцев, жгутиков и капсул)

- культуральные (характер роста на различных средах, наличие пигмента, который экстрагируется в среду или обнаруживается в структуре колоний, отношение к температуре, рН, кислороду и т.д.)

- физиологические признаки (способность разжижать желатин, осуществлять пептонизацию молока и т.д.)

Вторая группа - биохимические особенности (ферменты, определение типичных продуктов обмена – антибиотики, спирты и др., основные катаболические пути утилизации углеводов – дыхание, неполное окисление и т.д.)

Третья группа признаков – генетические, учитывается соотношение ГЦ:АТ пар, методы гибридизации ДНК-ДНК, нуклеотидные последовательности 16S-рРНК в методе ПЦР (не для всех штаммов имеются праймеры).

Серологические признаки – наличие антигенов, которые позволяют диагностировать (дифференциировать) виды, близко стоящие друг к другу.

Дополнительный признак – чувствительность бактерии к различным бактериофагам или актинофагам. Недостаток: среди актинофагов встречаются как специфические, так и полифаги (могут лизировать близкородственные актиномицеты или относящиеся к разным видам и родам).

 

Лабораторный регламент

Венцом лабораторных исследований является лабораторный регламент.

Лабораторный регламент – это технологический документ, которым завершаются исследования в лабораторных условиях по разработке метода получения антибиотика.

Он служит основой для разработки промышленного регламента.

Основная его задача – разработка оптимального метода производства антибиотического вещества.

Лабораторный регламент включает:

1) Характеристика АБ

· название антибиотика

· основное назначение

· краткое описание свойств препарата

· описание организма, который вырабатывает АБ

· методы определения биологической активности

· условия хранения

2) Прилагается технологическая схема

3) Указывается сырье и материал: требования к качеству сырья и материалов (ориентировка на отечественное сырье)

4) Аппаратурная схема производства

5) Изложение технологического процесса (описывается процесс получения АБ на основе завершенных научных и экспериментальных результатов, которые получены в лабораторных условиях). ТС описывается по этапам. Описывается обьем, концентрация, среда, рН, степень аэрации, условия перемешивания, пеногасители, температура, продолжительность процесса и т.д.

6) Отходы производства, технологические и вентиляционные выбросы в атмосферу, их использование и обезвреживание

· перечень возможных отходов и выбросов

· наличие в отходах ценных веществ и рекомендации к их использованию

· наличие вредных веществ с точки зрения загрязнения окружающей среды и способы их обезвреживания

7) Контроль производства

Указывают особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и комплектаций и т.д.); режимы стерилизации сред, отдельных веществ и воздуха; методы анализа процесса биосинтеза АБ и готовой продукции

8) Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария: перечень веществ способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, которые используются в процессе биосинтеза АБ, должны быть изучены с точки зрения безопасности.

9) Перечень производственных инструкций, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента

10) Технико-экономические нормативы

· выход продукта и промежуточных продуктов

· удельные нормы расхода сырья и материалов

· удельные нормы энергозатрат (пара, воды, ЕЕ, сжатого воздуха)

11) Информационный материал

· биологические и физико-химические свойства вещества

· степень очистки

· фармакологические свойства

· сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов

· сведенья о патентной чистоте препарата с перечнем охраняющихся авторских свидетельств

· вредность веществ и меры предосторожности работы с веществами

Повышение антибиотикообразования микроорганизмов продуцентов:

Для этого используют 3 этапа:

- селекция найболее активных форм подцуентов антибиотиков

- подбор ПС и подбор условий культивирования которые обеспецивают увеличение выхода антибиотика продуцентом

- порведение направленнгого биосинтез антибиотиков

 

Сульфур:

Содержится в белка в простетических группах некоторых ферментов. При ее отсутствии нарушается биосинтез белка.

S входит в структура нукоторых антибиотиков: цефалоспорины, пеницилины, бацитроцин, низин.

Колебание в среде источника S приводт к изменению биосинтеза антибиотиков.

 

Калий:

Выполняет такие функции:

- К-Na обмен к клетке

- каталитическая функция

- активатор амилазы и ряду других ферментов

 

Кальций:

- стабилизирует ЦПМ

- регулирует рН среды

- активирует ферменты

- влияет на усваивание – азота и фосфора клетками.

 

Магний:

- в хелатном соединении находится в Mg-АТФ

- регулирует активность ферментов

- принимает участие в стабилизации структуры ДНК

- влияет на процесс антибиотикообразования

 

Микроэлементы:

Входят в состав ферментов и и участвуют пв процессе метаболизма клетки. Также микроэлементы присутствуют в хелатных соединениях.

 

Железо:

- Играет каталитическую роль

- Входит в состав гемов цитохромов

- Включается в структуру некоторых антибиотиков

 

Медь:

Принимает участие в образовании некторых ферментных систем в сочетании с белками.

Fe и Cu у некоторызх антибиотиков выступают в роли антагонистов.

 

Цинк:

- Оказывает влияние на фосфатный и азотный обмены в клетке

- принимает участие в реакции окислительного фосфорилирования.

- имеет калалитическую роль в ДНК-полимеразе

- Участвует в синтезе некторых антибиотиков – хлорамфеникола, пенцицилина, стрептомицина.

Недостаток – может привести к нарушению формулы иРНК и синтеза белка

 

Кобальт:

Играет рол в биосинтезе антибиотиков – гентамицин и корамицин

 

Манган:

- Составная часть некоротых ферментов – карбоксилаз, фосфатаз

- Принимает участие в синтезе протеиназ

Галогены:

Играет роль в биосинтезе: тетрациклина, хлорамфеникола

2) Условия культивирования:

рН среды:

рН влияет на активность ферментов.

Оптимальное значение рН – нейтральное

Для актиномицетов – 6,7-7,8

Для ацитофильных актиномицетов – 3,5-7,6

В порцессе роста рН изменяется и подбирая состав среды его можног регулировать.

1) Если в среде источник азота – нитрат аммония и отсутствует Са, то при использовании азота будет идти резкое понижение рН.

2)  Если в качестве источника выступает нитрат калия, то при использовании азота буде происходить резкое выщелачивание.

 

Температура:

Все продуценты антибиотиков делятся на термофилов, мезофиллов и психрофилов.

 

Например: B. bravis – при t = 30 ^oC – культура развивается;

При t = 40 ^oC – осуществляется синтез антибиотика.

Отклонени температуроы клуьтивирования от нормы вызывает замедления и синтеза антибиотиков. Это изменения связано с:

а) изменением активности ферментов

б) изменением активности клеточных мембран

- изменение отношения ненасыщенных и насыщенных кислот в мембранах

- изменением состава клеточной стенки

- нарушение транспорта антибиотика через ЦПМ

 

Аэрация:

Большинство продуцентов антибиотиков – аэробные культуры. Степень аэрации – один из способов кислотно-восстановительных условий микроорганизма и служит основным процессом обмена веществ.

Существет три типа аэрации:

- встряхивание клуьтуральной жидкости на качалках

- выращивание микроорганизмов в виде пленки на поверхности плотной питательной среды.

- путем продувания определенного количесва воздухы через ПС (найболее эфективный метод)

Степень аэрации рассчитывается по такой формуле:

Обьем воздуха, л/ обьем ПС, л

 

Интенсивность аэрации:

Определяется скоростью вступления кислорода растворимого в среде.

Использует датчики с платиновыми или серебряными электродами.

Степень аэрации культур, котроые выращиваются в виде пленки на поверхнолсти можно регулировать изменение площади развития С и слоя жидкость аэрации будет больше.

Аэрация зависит от способа перешивания

Часто используется смешанно культивирование, когда всместе с продуцентом используют микроорганизм другого вида – интуктор образования антибиотиков.

 

Роль индуктора

1. Индуктор может выделять в клуьтуру жикость. Прдукты жизнедеятельности и эти продукты жизнедеятельности могут быть использованы продуцентом.

2. В смешанных культурах ферментативная реакция может быть использоваа ферментативной реацией другого организма.

3. Один мироорганизм может образовывать стимуляторы роста для другого микроорганизма

4. В смешанной культуре один микроорганизм мозжет выделять ферменты которые вызывают трансформацию антибиотика другого продуцента.

5. Образование продуктов жизнедеятельности индуктора вызывает приостановку роста микроба продуцента – микроорганизм начинает образовывать антибиотик.

 

Технология получения АБ

 

Выделение штамма-продуцента АБ из природных условий

↓

Селекция наиболее активного штамма

↓

Получение наиболее активного штамма путем

│

^{_________________________________________________________________________}

↓                                          ↓                                          ↓

Индуцированного мутагенеза  Слияния протопластов Генно-инженерных манипуляций

│                                          │                                         │

^{__________________________________________________________________________}

↓

Высокопродуктивный и экономически-выгодный штамм продуцента

↓

Продуцент

↓

      ПМ←ПС

↓

Подготовка иннокулята

↓

                    Смешанная культура→Культивирование←Монокультура

↓

Разделение

^{_________________________________________________________________________}

↓                                                                                           ↓

КЖ                                                                                       б/м

│                                                                                           │

^{__________________________________________________________________________}

↓

Выднление АБ

↓

Очистка   

↓

Концентрирование

↓

Стабилизация

│

^{_________________________________________________________________________}

↓                                                                                           ↓

             Обезвоживание                                                                 Стандартизация

                          ↓                                                                                           ↓

                Измельчение                                                                  Жидкий препарат

↓                                                                                                │  

            Сухой препарат                                                                                │             

                   ↓                                                                                            ↓

^{__________________________________________________________________________}

↓

Фасовка

↓

Хранение

 

 

Стадия биосинтеза включает: подготовку ПМ; производственное культивирование. Это основная биологическая стадия получения АБ. Главная задача этой стадии – создание оптимальных условий для развития продуцента. Результативность стадии зависит от стоимости ПС, стоимости предшественников, от уровня активности продуцента и времени накопления АБ в питательной среде, от общих энергетических затрат ит.д.

Стадия включает методы культивирования, стерилизации, подготовку ПМ. Для максимального выхода АБ разрабатывают комплекс мер включающих подбор ПС и режимов культивирования организма, который отвечает условиям управляемого биосинтеза.

Подготовка ПМ проходит в несколько стадий:

1) М.о. из лиофильно высушеного состояния пересевается на пробирку с агаризованной средой для подращивания на косячках.

2) С косячка – высев в колбу с жидкой ПС и подращивание на качалке. Культура должна достичь физиологической активности – середина логарифмической фазы роста.

3) Из колбы в колбу (регенерация культуры).

4) Высев в ферментер предварительного иннокулирования

5) В ферментер иннокулирования

6) Обьем 10-15% в основной ферментер

Производственное культивирование осуществляется в ферментерах:

· лабораторных, выполненных из нержавеющей стали или стекла, не более 30 л емкости, стерилизуют их в автоклаве и заполняют стерильной средой;

· полупроизводственные емкости (100 л);

· производственные ферментеры (500 л – 100 м³).

Стерилизация двух последних – прогретым паром.

Выращивание продуцентов ведут только глубинным способом культивирования. 4 модификации:

1. Периодическое культивирование в закрытой системе. При этом продуцент проходит все стадии роста. Процесс заканчивается синтезом АБ, после чего ферментер освобождается от КЖ, промывается, стерилизуется и вновь подготавливается

2. Отьемно-доливной способ. Периодический отбор от30% до 60% обьема общей КЖ и одновременно этот оббьем новой среды вносится в ферментер.

3. Батарейный способ. М.о. развивается в ряду последовательно соединенных ферментеров. КЖ на определенной стадии развития перекачивается из одного ферментера в другой, а освобожденный ферментер загружается свежей ПС. Этот способ рационален.

4. Метод непрерывного культивирования. В основе – метод непрерывного протока ПС. Скорость потока определяется таким образом, чтоб поддерживать культуру на определенной стадии развития.

Периодический способ обеспечивает больший выход, но в промышленности используют непрерывный – более технологичный. Но в промышленных условия непрерывный способ ведут в 2 стадии: 1) в первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость роста; 2) во втором аппарате поддерживают низкую скорость роста, здесь происходит биосинтез АБ.

В процессе культивирования уделяется большое внимание пеногашению, которое определяется тем, что в ПС содержатся белковые вещества, и высокой вязкостью самой среды. Пеногасители: кашалотовый жир, растительные масла (соевое, подсолнечное), минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты, синтетические вещества.

Когда внесение пеногасителя снижает выход продукта, используют механическое пеногашение: отсасывание пены; разрушение пузырьков пены и т.д.

Выделение и очистка. Выделение АБ по окончанию культивирования определяется его местом локализации. У большинства продуцентов АБ выделяется в КЖ, у другой части – выделяется и какое-то количество сосредотачивается внутри клетки, у небольшого числа – полностью внутри клетки.

В зависимости от продуцента:

- фильтрация;

- центрифугирование;

- сепарирование.

При центрифугировании важно выбрать режим, который позволит полностью отделить б/м от КЖ. Используют до 15 тис. об/мин.

При сепарировании – 7-7,5 тис. об/мин.

Для грибов микромицетов используют фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр. Фильтр-пресс используют для больших обьемов производства (фильтрование давлением). Два других фильтра – для небольших обьемов. Нутч-фильтр работает под вакуумом, друк-фильтр – под давлением над фильтрующей жидкостью.

После отделения КЖ и клеток, АБ извлекается из места локализации и очищается. Если АБ находится в КЖ его извлекают методом экстракции (используют органические растворители, которые не смешиваются с водной фазой) или используют сорбцию, применяя ионно-обменные смолы. Если АБ находится в клетках, то его экстрагируют органическими растворителями.

Концентрированное антибиотическое вещество подвергают очистке. Цель очистки – сконцентрировать и очистить от балластных и неактивных компонентов.

Методы очистки:

1) Перекристаллизация – это многократный переход АБ из растворителя в растворитель с предварительным осаждением

2) Ионообменная сорбция

3) Осаждение – АБ связывают с органическими или неорганическими веществами для получения соединения, которое выпадает в осадок. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием, отмывают и высушивают.

C тановления учения о антибиотиках. Общие свойства антибиотиков

1912 г. – Пауль Эрлих синтезировал мышьяковистый препарат «сальварсан», он убивал возбудителя сифилиса – бледную трепонему. По химическому строению это диоксидиаминоарсенобензол.

30е годы – в результате химического синтеза получены сульфаниламиды, среди которых самые эффективные – красный стрептоцид (при стрептококковых инфекциях). В организме распадаются на 2 соединения – амид сульфаниловой кислоты (очень эффективное) и триаминобензол (не обладает антибактериальной активностью и вызывает аллергию)

Позже синтезировали белый стрептоцид, который тоже обладал высокой аллергенностью.

1937 г. – синтезирован сульфидин, который уступил место сульфаниламидным препаратам (фталазол, этазол, сульфален и ряд других препратов).

1930-е – обнаружены статьи Полотебнова, который говорил о том, что плесень р. Penicillum задерживает рост возбудителей кожных инфекций, а в 1913 г. Блэком и Алсбергом была выделена пенициллиновая кислота, обладающая антимикробными свойствами.

1929 г. – Александр Флеминг открыл новый препарат пенициллин, выделен и очищен в 1940 (Флори и Чейн). Это первый препарат – продукт микробного синтеза, который обладал противомикробной активностью.

1943 г. – в СССР создана лаборатория (Ермольева З.В.) антибиотиков. Удалось найти продуцент Penicillum crustozum, который стал первым продуцентом отечественного антибиотика крустозина.

40-е годы – становление науки об антибиотиках.

1942 г. – Гаузе и Бражникова открыли (из подмосковных почв) продуцент грамицидина (Грамицидин С), продуцент – Bacillus brevis.

1945 г. – открыт полипептидный антибиотик бацитрацин, Bacillus liheniformis.

1944 г. – в лаборатории Ваксмана открыт стрептомицин, p. Streptomyces (актиномицеты)

 

На сегодня известно около 20 тысяч антибиотиков.

Лидеры производства – США, западная Европа (Германия), Япония, Китай (субстанции).

Несмотря на большое количество известных антибиотиков, активно ведется поиск новых.

Причины поиска новых препаратов:

1. Увеличение числа заболеваний, вызванных Г- микроорганизмами, которые в силу строения клеточной стенки менее активно пропускают препараты в клетку – природная устойчивость.

2. Появились антибиотикорезистентные штаммы.

3. Не существует ни одного эффективного противовирусного препарата.

4. Запросы сельского хозяйства.

5. В пищ. промишленности как консервант (АБ белкового происхождения)

5. Антибиотики широко используются в научных исследованиях.

 

Термин «антибиотик» был введен в 1942 г. Ваксманом. В переводе с греческого означает «против жизни».

Определение Ваксмана: химические вещества, которые выделяются микроорганизмами, которые способны подавлять рост и развитие других микроорганизмов.

Недостатки определения:

- сужен круг организмов-продуцентов антибиотиков

- химические вещества, которые подавляют жизнедеятельность – очень широкое понятие

Современное определение: АБ – специфические продукты жизнедеятельности организмов, а также их производные и синтетические аналоги, которые обладают высокой физиологической активностью и избирательностью действия по отношению к микроорганизмам, вирусам и клеткам злокачественных опухолей.

Изменения:

- продуценты – любые организмы

- к антибиотикам отнесены синтетические аналоги природных веществ, а также те, которые получены микробной трансформацией

- антибиотики, в отличие от перекиси, спиртов и органических кислот обладают высокой физиологической активностью (в очень низких концентрациях, например, спирт – 70%, перекись – 3%, а пенициллин – 10^-6 г\мл)

- антибиотики обладают избирательностью действия (свой спектр действия – совокупность микроорганизмов, которых они подавляют)

- расширен ряд организмов, на которые действуют антибиотики.

 

Антибиотики могут накапливаться внутри клеток, во внешней среде или образовывается в виде летучих соединений, но не являются метаболитами, а являются результатами направленного биосинтеза (неправильно называть вторичными метаболитами). Образование антибиотиков – наследственно закрепленная особенность метаболизма продуцента.

 

Роль, которую играют антибиотики в жизни продуцента:

· конкуренция между видами (образование и выделение антибиотиков во внешнюю среду в естественных условиях является мощным фактором в борьбе за существование)

· дает селективные преимущества в конкуренции с другими видами (70% антибиотиков – актиномицеты, что связано с особенностью их физиологии – низкая скорость роста, в целях сохранения вида эволюционный отбор шел в сторону сохранения тех штаммов, которые обладали способностью синтезировать антимикробные вещества – антибиотики и антибактериальные ферменты)

· регуляция обмена (ряд полипептидных антибиотиков), предполагают, что эдеины, полимиксины, бацитрацины у споровых бактерий регулируют отдельные стадии спорообразования, ионоформные антибиотики могут также выполнять метаболическую функцию, участвуют в транспортировке ряда катионов внутрь клетки.

 

Причины нечувствительности продуцентов к собственным АБ:

1. Микроорганизмы репрессируют синтез антиботиков в период быстрого роста и развития (логарифмическая фаза). При развитии культуры выделяют две фазы биосинтеза антибиотиков:

I – логарифмическая фаза роста: интенсивный рост, развитие культуры, накопление биомассы, культура потребляет основные источники из среды (углерод, фосфор, другие макро- и микроэлементы), образование антибиотика очень незначительно.

II – стационарная фаза роста: снижение накопления биомассы, преобладает автолитические процессы, накапливаются продукты метаболизма, изменяется рН среды, на фоне неблагоприятных условий для развития появляются клетки, развитие которых происходит в новых условиях – активный синтез антибиотических веществ, разрыв между максимальным ростом и максимальным биосинтезом определяется природой продуцента и условиями культивирования. Так, биосинтез b-лактанных антибиотиков – цефалоспоринов – начинается через сутки после посева грибной культуры, наиболее интенсивный синтез – 24-108 часов после посева. Синтез антибиотиков для данного продуцента репрессируется в первую фазу глюкозой (катаболитная репрессия), ионами аммония, фосфором. Когда же уровень этих веществ исчерпывается, то репрессия снимается, биосинтез антибиотика восстанавливается. Антибиотики синтезируются тогда, когда продуцент к нему физиологически нечувствителен.

 

2. Ряд продуцентов антибиотиков отличаются от низкопродуктивных штаммов проницаемостью для антибиотиков. Гиперпродуктирующие штаммы легко выбрасывают антибиотики за п