Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Методы идентификации Т-лимфоцитов.
Функциональные и количественные тесты.
Для определения количества Т-лимфоцитов используются несколько методов: 1. метод розеткообразования с эритроцитами барана – устарел. 2. с применением моноклональных АТ. 3. иммунофлюоресценция в т.ч. проточная. 4. цитофлюоресценция. 5. ИФА.
Функциональные тесты.
Важны т.к. не всегда снижение количества свидетельствует об их функциональной недостаточности и наоборот.
1. РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (РБТЛ). В асептических условиях из вены берется 5 – 10 мл крови в пробирку, содержащую 100 – 200 ЕД. гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t 37°С для осаждения эритроцитов, которое может быть ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный спой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную пробирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД. пенициллина и 100 ЕД. стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 1.000.000 – 2.000.000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды. Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стерильные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного аллергена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t 37°С на 5 – 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобождается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие ЛФ, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги. Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами. Морфологический метод заключается в подсчете в окрашенном мазке активированных клеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического аллергена может достигать 35%.
Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета, включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного ЗН-тимидина, добавляемого в культуральную среду. Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследованиями с культурой исследуемых ЛФ без добавления аллергена (для выявления спонтанной Б.л.) и с культурой ЛФ здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим аллергеном.
2. РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (РТМЛ) Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенсибилизированных к предполагаемому антигену. Если антиген является специфичным в данной ситуации, то диффузия лимфоцитов будет минимальной. Такая положительная проба свидетельствует о наличии фактора ингибиции. Методика исследования. Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0.35% раствор NaOH, тирс-буфер (рН 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0,7 мм. Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (рН 7.4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добавленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40мии плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспензируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9частей 0,35% раствора NaOH и 1 части тирс-буфера (рН 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% человеческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0.7 мм Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56°С в течение часа человеческой сыворотки 1; можно также использовать сыворотку лошади, кролика, оспа и др.
Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из органического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37°С, Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в еще своего рода "дерева", стволом которого является капилляр, а кроной - лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра Регистрацию можно проводить с помощью планиметра ирисовального аппарата. Показатель торможения миграции выражают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свидетельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.
РТМЛ – позволяет косвенно судить о эфекторной функции лимфоцитов и отражает ГЗТ. Кроме того, функциональное состояние CD 4+ клеток. Тестируют по цитокиновому профилю, по функциональной способности синтезировать γ – ИФН, а Тх2 – синтезировать ИЛ – 4.
3.
Для CD 8 ЦТЛ – тест цитотоксичности – клетки мишени в т.ч. различные линии опухолевых клеток меченных радиоактивным изотопом, а по количеству высвобождаемого изотопа судят о величине цитотоксической активности лимфоцитов.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-12-15; просмотров: 29; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.221.53.209 (0.008 с.) |