Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования.

Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования.

1. Взятие материала: секционным (получ в ходе операции); биопсийным (от живого животного, без операции); трупный (берется не позднее 3ч. после смерти при комнатной температуре). Размер 1*1*0,5.

2. Фиксация: цели – убить клетку и сохранить прижизненное состояние. Время от взятия до фиксации не более 1,5 часа (в особых случаях не более 30 мин – железы экзокринной системы).

Физические и химические фиксаторы:

· Физ. – низкие температуры, чтобы быстро заморозить и медленно оттаять.

· Хим. - простые и сложные

Простые (состоят из 1 действующего вещ.). 1. Формалин разводят водопроводной водой 1\3, 1\4. Время от 24 часов при комнат темпер. При пониж темпер - время фиксации удлин, а качество – улучшается. При повышении темпер – время укор, а кач – ухудшается (денатурация белка происходит). Преимущества – доступность, материал сохр длит время, не вызывает сильной деформации тканей и клеток, не раствор жиры. Недостатки – вымывает из клетки углеводы, вызывает у исследователя раздражение слизистых оболочек (формалиновый насморк). 2. Спирт 80-90 ^о , время от 12 часов. Преимущества – доступный, быстрота фиксации, не раствор углеводы. Недостатки – сильно сморщивает клетки, растворяет жиры. 3. Сулеман – содер ртуть, очень хороший фиксатор, ядовитый. 4. Осмиевая кислота – идеальный фиксатор, испол в электрон микроскопии.

Сложные: 1. Спирт-формалин – состоит из равных частей неразведен формалина и спирта 80-96 ^о, дейстует более мягко, чем спирт. 2. Жидкость Карнуа – хлороформ, ледяная уксусная кислота, абсолютный спирт, быстрая фиксация – 4 часа. 3. Жидкость Буэна – содержит пикриновую кислоту.

3. Обезвоживание или Уплотнение – необ сделать ткань прозрачной, производятся в ряде спиртов по возрастанию крепости - 80, 90 и  абсолютного спирта. В каждом спирте, кроме абсолютного, материал дол находиться 1 сутки, в абсолютном не более 3 часов. Материал после абсол спирта переносят в смесь абсол спирта и эфира на 12 ч., потом в чистый эфир 12 ч.

Техника изготовления срезов, их окраска и заключения.

4. Заливка промежуточной среды – должна обладать высокой пластичностью, легко проникать в клетки, не вызывая в них изменения. Используют: эпоксидные смолы (для электронной), целлоидин, парафин.

Материал после абсол спирта переносят в смесь абсол спирта и эфира на 12 ч., потом в чистый эфир 12 ч., далее жидкий раствор целлоидина 1-2 дня; далее густой раствор целлоидина на сутки; далее целлоидин, уплотненный в парах хлороформа, 12 ч; далее бритвой вырезают целлоидиновые блоки, которые хранят в 70^о спирту. 

(помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 ^о С. Дают парафину затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание.)

Преимущества – не тратят спец оборудование, не вызывает сильное затвердевание ткани.

Недостатки – невозможно получ тонкие срезы, невоз получ серийных срезов, материал сохраняется недолгое время.

5. Изготовление среза – с помощью микротома, микротомный нож срезает с блока с заключённым образцом тонкой слой органа (срез), парафиновые срезы прикрепляют к предметному стеклу с помощью белка глицерина, высушивают при 37 гр 12 часов.

6. Депрофинирование – стекла со срезами помещ в ксилол на 3-5 мин, далее в спирт 96 на 5 мин, далее всполаскивают дистил водой.

 7. Окраска – с пом гистологич красителей: основные или ядерные (гематоксилин), кислые или цитоплазматические (эозин, оранж), специальные (окрашивают соед ткань, слизь).

Самая распр окраска – гематоксилин-эозин: гематоксилин 1-5 мин, дистил вода, эозин 10 мин, дифферинцируют в 2х порциях спирта по 3-5 мин в каждой, обезвоживают карбол в ксилоле 10-15 сек, просветляют в ксилоле 3-5 мин.

Микроскопируют.

Полное дробление.

1. Полное равномерное дробление - характерно для олиголецитальных, изолецитальных яиц (ланцетник). Две первые борозды меридиональные делят зиготу на 2 бластомера, затем на 4. Экваториальная борозда (третья) делит на 8 бластомеров: 4 из вегетативного полюса (нижнего) и 4 из анимального. Последующие меридиональные борозды делят на 16, 32, 64 – на этой стадии деления обр морула. После седьмого дробления (128) – однослойная бластула: стенка бластодерма и полость бластоцель. В бластодерме из мелких клеток – крыша, из крупных – дно. Так у ланцентика обр равномерная односл бластула – целобластула.

2. Полное неравномерное – для мезолецитальных, телолецитальных (амфибии). Две взаимо-перпендикулярные меридиональные борозды делят на 4 бластомера, широтная делит лишенный желтка анимальный полюс на 4 мелких бластомера – микромера, а вегетативный – на 4 крупных - макромера. Снова меридиональные, а после широтные борозды – при этом бластомеры анимального полюса дробятся быстрее вегетативного – асинхронное дробление. Дно из макромеров, крыша из нескольких слоев микромеров. Весь желток в макромерах. Бластоцель сдвинута к анимальному полюсу. Образуется многослойная неравномерная целобластула.

Частичное дробление.

Для полилецитальных, телолецитальных яиц (рептилии, птицы, яйцекладущие млекопитающие). Дробится только участок свободный от желтка (анимальный полюс), где располагается ядро. Остальная вегетативная часть, заполненная желтком, не дробится, бластоцель не образуется. Первые 2 меридиональные борозды проходят через анимальный полюс перпендик др др. 4 бластомера не отделены др от др по периметру, а связаны общим основанием – желтком не раздробленным. Радиальные и широтные борозды, а тангенциальная приводит к появл на поверхности желтка одного слоя бластомеров. Формируется дискобластула. Тип дробления дискоидальный.

Образование и дифференцировка мезодермы.

У всех животных в связи с гаструляцией возникает и третий зародышевый-пласт — мезодерма. Это совокупность клеточных элементов, залегающих между эктодермой и энтодермой, т. е. в бластоцеле. Таким образом, зародыш становится не двухслойным, а трехслойным. У высших позвоночных трехслойное строение зародышей возни­кает уже в процессе гаструляции, тогда как у низших хордовых и у всех других типов в результате собственно гаструляции обра­зуется двухслойный эмбрион.

Формирование мезодермы у разных животных имеет два разных пути возникновения: телобластический и энтероцельный. У первичноротых во время гаструляции на границе между эктодермой и энтодермой, по бокам бластопора, уже име­ются две большие клетки (телобласты), отделяющие от себя (вследствие делений) мелкие клет­ки. Таким образом, формируется средний пласт — мезодерма. Телобласты, давая новые и новые поколения клеток мезодермы, остаются на заднем конце зародыша. По этой причине такой способ образования мезодермы и называют тело­бластическим (от греч. telos — конец).

При энтероцельном (ланцетник) способе клетки мезодермы выпячиваются в бластоцель в виде мешочков первичной кишки, обособляясь от нее. Полость мешочков превраща­ется в целом, т. е. во вторичную полость тела, целомические меш­ки (мезодерма) могут подразделяться на сегменты.

У млекопитающих средний зародышевый листок, образуюется путем разрастания первичной полоски в виде слоя клеток между экто- и энтодермой.

Мезодерма дифференцируется на 3 части: 1) дорсальная часть - сомиты; 2) вентральная часть — спланхнотом расщепляется на 2 листка — париетальный прилежит к эктодерме и висцеральный — прилежит к энтодерме, они замыкаются и заключают вторичную полость тела — целом; 3) участок, соединяющий сомиты и спланхнотом, — сегментная ножка, или нефрогонадотом. Нефрогонадотом сегментируется вслед за сомитами.

Каждый сомит в дальнейшем подразделяется на 3 части: склеротом — костная и хрящевая ткань осевого скелета, миотом — поперечно-полосатая скелетная мышечная ткань, и дерматом — соединительнотканная основа кожи. Нефрогонадотом даст начало эпителию выделительной и половой систем. Париетальный и висцеральный листки спланхнотома преобразуются соответственно в париетальный и висцеральный листки серозных оболочек (брюшины, плевры, перикарда), а целом — в соответствующие серозные полости тела. Помимо этого, из спланхнотома выселится большая часть клеток мезенхимы, которая даст начала соединительной и гладкомышечной ткани большинства внутренних органов.

27. Эмбриональные источники образования тканей и органов.

У млекопитающих: из эктодермы образуется эпидермис кожи и нервная пластинка. Из последней развивается вся нервная система: из нервной трубки – ЦНС, из нервного гребня – периферическая (ПНС).

  Мезодерма: (сомиты) из миотомов формируются скелетные мышцы. Из склеротомов выделяются клетки мезенхимы, которые дают костную и хрящевую ткань, сосуды. Из дерматомов соединительнотканная основа кожи. Из материала сегментных ножек (нефрогонадотомы) образуются мочевыделительная и половая система. Из париетального листка спланхнотома формируется эпителий париетального листка плевры легких, сердечной сумки и костальной плевры; из висцерального листка – эпителий серозных оболочек органов грудной и брюшной полостей.

Из энтодермы образуется эпителий, выстилающий внутреннюю поверхность пищеварительной трубки, и ее производные: органы дыхания, печень, поджелудочную железу.

Строение и развитие зуба.

Резцы, клыки, моляры и премоляры. В зубе выделяют коронку, шейку и корень.

Коронка – снаружи покрыта эмалью – имеет неклеточное строение и образована обызвествленными эмалевыми призмами. Из-за своей формы и большого кол-ва неорганического соединения эмаль явл самой прочной тканью.

Шейка и корень – снаружи покрыты цементом, по строению напоминают грубоволокнистую костную ткань, но лишена кровеносных сосудов. Состоит из клеток – цементоциты и цементобласты – и плотного межклеточного вещ. Выделяют 2 типа цемента:

- бесклеточный – первичный, покрывает шейку.

- клеточный – вторичный, покрывает корень.

Глубже располагается дентин, состоит из обызвествленного межклеточного вещ, пронизанного дентиновыми трубочками, в них проходят отростки клеток одонтобластов. Пульпа – самая глубокая часть зуба, из рых соед ткани, в ней проходят кровен сосуды и нервы.

Развитие зуба:

 На определенном этапе эмбриогенеза в ротовой полсти происходит утолщение эпителия на месте закладки зубов. Формируется зубная пластинка, от нее в определенных участках под лежащую мезенхиму отшнуровывается часть материала, которая дает начало зачатку зуба – эмалевому органу (напоминает перевернутый бокал). В нем выделяют: внутренний эпителий, наружный эпителий и между ними пульпу эмалевого органа.

В образовании зуба принимает участие и мезенхима, та часть, которая окружает эмалевый орган – зубной мешочек, а часть, которая врастает в чашу бокала – зубной сосочек.

Далее активно развивается внутренний эпителий и материал зубного сосочка. Из внутреннего эпителия образ клетки энамелобласты – продуцируют эмаль. Из клеток зубного сосочка образ одонтобласты – продуцируют дентин.

Таким образом, эмаль эктодермального происхождения, дентин и пульпа – мезенхимального. 

*74. Особенности строения пищевода домашних животных.

Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования.

1. Взятие материала: секционным (получ в ходе операции); биопсийным (от живого животного, без операции); трупный (берется не позднее 3ч. после смерти при комнатной температуре). Размер 1*1*0,5.

2. Фиксация: цели – убить клетку и сохранить прижизненное состояние. Время от взятия до фиксации не более 1,5 часа (в особых случаях не более 30 мин – железы экзокринной системы).

Физические и химические фиксаторы:

· Физ. – низкие температуры, чтобы быстро заморозить и медленно оттаять.

· Хим. - простые и сложные

Простые (состоят из 1 действующего вещ.). 1. Формалин разводят водопроводной водой 1\3, 1\4. Время от 24 часов при комнат темпер. При пониж темпер - время фиксации удлин, а качество – улучшается. При повышении темпер – время укор, а кач – ухудшается (денатурация белка происходит). Преимущества – доступность, материал сохр длит время, не вызывает сильной деформации тканей и клеток, не раствор жиры. Недостатки – вымывает из клетки углеводы, вызывает у исследователя раздражение слизистых оболочек (формалиновый насморк). 2. Спирт 80-90 ^о , время от 12 часов. Преимущества – доступный, быстрота фиксации, не раствор углеводы. Недостатки – сильно сморщивает клетки, растворяет жиры. 3. Сулеман – содер ртуть, очень хороший фиксатор, ядовитый. 4. Осмиевая кислота – идеальный фиксатор, испол в электрон микроскопии.

Сложные: 1. Спирт-формалин – состоит из равных частей неразведен формалина и спирта 80-96 ^о, дейстует более мягко, чем спирт. 2. Жидкость Карнуа – хлороформ, ледяная уксусная кислота, абсолютный спирт, быстрая фиксация – 4 часа. 3. Жидкость Буэна – содержит пикриновую кислоту.

3. Обезвоживание или Уплотнение – необ сделать ткань прозрачной, производятся в ряде спиртов по возрастанию крепости - 80, 90 и  абсолютного спирта. В каждом спирте, кроме абсолютного, материал дол находиться 1 сутки, в абсолютном не более 3 часов. Материал после абсол спирта переносят в смесь абсол спирта и эфира на 12 ч., потом в чистый эфир 12 ч.