Протокол обратной транскрипции (синтеза первой цепи кДНК)

Приготовили смесь из компонентов, приведённых в таблице 2, в стерильной пробирке:

Таблица 2- Состав смеси для синтеза кДНК

Х мкл	Вода для ПЦР
1–6 мкл	РНК матрица (0.5–2 мкг)
1–3 мкл	Праймер (20 мкМ)
9 мкл	Суммарный объем первой части реакционной смеси.

Выбрали необходимый праймер. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Прогрели смесь 2 мин при 70 °C для расплавления вторичных структур РНК и перенесли образцы в лед. Сбросили капли реакционной смеси со стенок пробирки на микроцентрифуге.  Добавили 11 мкл предварительно подготовленной смеси, состав которой приведён в таблице 3.

Таблица 3- Состав реакционной смеси, добавленного в пробирку с РНК матрицей

Х мкл	Вода для ПЦР
4 мкл	5х буфер для синтеза первой цепи
2 мкл	Смесь dNTP (10 мМ каждого)
2 мкл	DTT (20 мМ)
1–3 мкл	MMLV ревертаза (добавили в последнюю очередь)
11 мкл	Суммарный объем второй части реакционной смеси

     Для предотвращения возможной деградации проб добавили в реакцию ингибитор РНКаз. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Инкубировали реакционную смесь 30–60 мин при 37–42 °C. Реакцию проводили в сухом термостате. Для этого наслоили поверх реакционной смеси 1 каплю (15–20 мкл) минерального масла, чтобы объем реакции не изменился из-за испарения. Для остановки реакции прогрели смесь при 70 °C в течение 10 мин.

Определение относительного уровня экспрессии генов

Относительный уровень экспрессии генов определяли методом количественной ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) на 3-й, 6-й и 9-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из венозной крови из хвостовой вены.

Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения кДНК.

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени использовали интеркалирующий агент SYBR Green. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция данного вещества значительно возрастает при внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.

Высушенные осадки РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбонатомдеионизированной воде. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра Nano Drop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) по оптической плотности на длине волны 260 нм. Для проведения обратной транскрипции брали 1 мкгРНК каждого образца и помещали в термостат на час при 37-38°С. 

Для проведения ПЦР по технологии TaqMan (Applied Biosystems, США) к 2 мкл кДНК образцов добавляли реакционную смесь, содержащую МастерМикс и праймеры, приведённые в таблице 4.

Таблица 4- Состав реакционной смеси на 1 реакцию, для проведения ПЦР по технологии TaqMan

Вода	5,5 мкл
МастерМикс	2,0 мкл
Праймеры	0,5 мкл
Объем кДНК	2 мкл

Амплификацию проводили в термоциклере Real-time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США) по следующей программе: “горячий старт” – +95°С, 5 мин; денатурация – +95°С, 15 сек, отжиг праймеров и элонгация с регистрацией флуоресценции – +56°С, 30 сек (40 циклов) (таблица 5).

Таблица 5- Условия термоциклирования

95 °С	5 минут
95 °С	15 секунд
56 °С	30 секунд*

 

40 циклов

 

 

*детекция по каналу SYBR

Рисунок 15. Кривые накопления Сt количественной ПЦР на ген Htr 4. По оси ординат RFU – сигнал флюоресценции, по оси функции – количество циклов. Используемый фюоресцентный краситель Sybr.

Каталожные номера всех продуктов, используемых в данной дипломной работе приведены в таблице 6.

Таблица 6- каталожные номера продуктов