Изменение экспрессии генов серотониновой системы под действием разной хронической нагрузки у крыс

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СЕРОТОНИНОВОЙ СИСТЕМЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ У КРЫС

 

по направлению: 06.03.01 - Биология

 

Работа завершена:

"___"_________ 20__ г.            ____________________  (Р.Д. Мухаметшина)

 

Работа допущена к защите:

Научные руководители:

доц., канд. биол. наук

"___"_________ 20__ г.            ____________________ (О.А. Кравцова)

 

асс., аспирант

"___"_________ 20__ г.            ____________________ (Е. В. Валеева)

 

Заведующий кафедрой

д-р биол. наук

"___"_________ 20__ г.            ____________________ (Р.Г. Киямова)

 

Казань–2020

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.. 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... 7

1.1. Понятие и источники стресса. 7

1.2. Влияние физической нагрузки на экспрессию генов. 10

1.3. Влияние стрессовых факторов на серотонинэргическую систему. 10

1.4. Серотонинэргическая система. 13

1.5. Гены, кодирующие белки, вовлеченные в метаболизм серотонина, его инактивацию и рецепции. 14

1.5.1.  Серотонин и его функции и метаболизм. 15

1.5.2. Транспортёр серотонина. 17

1.5.3. Катаболизм серотонина. 19

1.5.4. Рецепторы к серотонину. 21

1.6. Взаимосвязь функционирования серотониновой системы с эндокринной регуляцией. 30

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. 33

2.1. Объекты исследования. 33

2.2 Методы исследования. 33

2.2.1 Способ осуществления стресс-теста. 34

2.2.2 Способ осуществления физической нагрузки крыс. 35

2.2.3. Выделение РНК.. 36

2.2.4. Синтез кДНК.. 38

2.2.5. Определение относительного уровня экспрессии генов. 39

2.2.6. Оценка относительного уровня экспрессии генов. 41

2.2.7. Определение уровня гормона кортизола в крови. 41

2.2.8. Статистический анализ. 41

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.. 42

3.1 Сравнительный анализ относительного уровня экспрессии генов серотониновой системы в ходе проведения 9-ти месячного эксперимента. 42

3.2.1 Изменение концентрации кортизола (нМ/л) в сыворотке крови у крыс разных групп в ходе проведения 9-ти месячного эксперимента. 49

3.2.2 Изменение концентрации кортизола (нМ/л) в сыворотке крови у крыс разных групп относительно начала эксперимента. 51

3.3. Корреляционная зависимость между уровнем кортизола и действием различных стрессовых факторов на относительный уровень экспрессии генов серотониновой системы после 3, 6 и 9 месяцев воздействий в экспериментальных группах крыс 52

ВЫВОДЫ... 56

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. 57

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ... 59

 

ВВЕДЕНИЕ

Хронический стресс распространен в современном обществе и может оказать пагубное влияние на физическое здоровье организма. Термин «стресс» в биологическую литературу впервые ввел У. Кеннон. Этим термином он описывал напряжение при биологическом нарушении гомеостаза в живом организме.

На современном этапе под стрессом понимается состояние эмоционального и физического напряжения, которое возникает в трудных условиях, как в специфических обстоятельствах, так и в повседневной жизни. При этом происходит физическая, психическая, эмоциональная и химическая реакция тела на то, что пугает, раздражает его или угрожает организму, то есть это неспецифический комплекс реакций, возникающий на организменном уровне (организменный стресс) в ответ на внешние воздействия и включающий в себя активацию неспецифических защитных систем организма: нейро-эндокринно-иммунных, внутриклеточных, геномных.

Действие хронического стресса является последствием возникновения психологических расстройств, включающих депрессию, панические атаки и т.д., количество людей, болеющих данными типами заболеваний неуклонно растет и в настоящее время данные виды отклонений здоровья превосходят большинство других основных заболеваний. По данным ВОЗ к 2030 г. депрессивные расстройства выйдут на первое место в мире среди причин утраты здоровья, опередив сердечно-сосудистые заболевания (ВОЗ, 2001; Статистические данные, 2013).

Центральная роль серотонинергической системы мозга при депрессивных расстройствах, возникающих под действием стрессовых факторов подтверждена результатами клинических и экспериментальных исследований (Chistiakov et al., 2012). Однако несмотря на это основные механизмы нарушений функциональной активности этой системы при депрессии не ясны (Artigas, 2013). Так, согласно одной гипотезе, депрессию связывают с гипофункцией серотонергической системы (Августинович, 2004), а другая основывается на повышении ее активности (Artigas, 2013). Учитывая многоуровневое строение и сложный характер взаимодействия структур серотонинергической системы, нарушение на любом из уровней в ее регуляции может играть определенную роль в патогенезе аффективных расстройств (Elhwuegi, 2004).

С агрессией и депрессией связано как непосредственное изменение концентрации серотонина в головном мозге, так и активность других компонентов серотониновой системы (рецепторов к серотонину, серотонинового транспортера и др.). Чувствительными к действию того или иного стрессора оказываются в первую очередь рецепторные клетки и клетки соответствующих отделов центральной нервной системы, участвующих в обработке пришедшего сигнала. Поэтому изучение экспрессия генов серотониновой системы является одним из новых биомаркеров, позволяющих оценивать общее состояние организма, прогнозировать возникновение некоторых заболеваний и их исходов. 

Для нахождения новых путей терапии многих недугов необходимы исследования, в том числе такие, в которых прослеживается влияние различных факторов как внешних, так и внутренних на экспрессию генов CТ- системы. В настоящее время происходит активное изучение взаимосвязи действия хронического стресса на организм и изменения экспрессии генов данной системы.

В данной дипломной работе было сосредоточено внимание на изучении влияния хронического стресса и физических нагрузок на изменение уровня кортизола как маркера стресса, а также определение изменения экспрессии гена триптофангидроксилазы - фермента, участвующего в синтезе серотонина и мелатонина- Tph 1 и Tph 2, одного рецепторного гена (Htr 4), и одного гена переносчика Slc 6 a 4, помимо этого, изучение корреляционной зависимости уровня кортизола с изменением экспрессии данных генов серотониновой системы, с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени TaqMan.

Научная новизна данной работы заключается в разработке нового подхода к исследованию влияния стресса на экспрессию генов серотониновой системы, рассмотрении того, каким образом влияет гиподинамия и физическая нагрузка крыс на экспрессию генов данной системы, помимо этого происходит обобщение имеющихся теоретических подходов с целью формулирования своего, наиболее полного и современного вывода.

В связи с этим целью настоящей работы является оценка влияния различных типов хронического стресса на изменение относительного уровня экспрессии ряда генов серотонинэргической системы у крыс линии Вистар.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1) Определение относительного уровня экспрессии генов Tph 1, Tph 2, Htr 4 и Slc 6 a 4 на вивальной модели крыс линии Wistar, подвергавшихся различным видам хронического стресса (изнурительная физическая нагрузка, иммобилизационный стресс, комбинированное сочетание) и особей контрольной группы.

2) Оценка изменения уровня гормона кортизола в исследуемых группах как маркера хронического стресса.

3) Корреляционный анализ между уровнем экспрессии мРНК генов серотонинэргической системы и кортизолом в исследуемых группах.

 

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Понятие и источники стресса

Организм животных и человека испытывает многообразные и постоянные воздействия со стороны окружающей среды, что сопровождается формированием определенных эволюционно выработанных ответных реакций, обеспечивающих адекватное приспособление и жизнедеятельность в конкретных условиях существования. Однако эти воздействия нередко приобретают необычно сильный, чрезвычайный и экстремальный характер, вызывающий напряжение организма или стресс.

Впервые термин «стресс» в физиологию и психологию ввел Уолтер Кэннон (англ. Walter Cannon) в своих классических работах по универсальной реакции «бороться или бежать» (англ. fight-or-flight response). По своей биологической сущности стресс - это совокупность стереотипных адаптивных реакций (общий адаптационный синдром - ОАС), в основе которых лежат процессы возбуждения гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой и других систем организма (Куликов, 2001). Под понятием общий адаптационный синдром подразумевается сочетание стереотипных реакций, возникающих в организме в ответ на действие чрезвычайных раздражителей (стрессоров) и обеспечивающих ему устойчивость не только к стрессовому агенту, но и по отношению к другим болезнетворным факторам. Родоначальником теории стресса является Ганс Селье, который определял стресс как «неспецифический ответ организма на любое воздействие». Воздействия (стрессоры) могут поступать как из внешней, как и из внутренней среды, нарушая здоровье организма. Стрессор – это стимул, вызывающий стрессовую реакцию.

Реализация процесса адаптации к воздействиям нефизиологичных факторов окружающей среды осуществляется за счет мобилизации энергетических и пластических ресурсов организма (Карюк, 2004). Замедление скорости адаптационных процессов приводит к тому, что нарушение гомеостаза сохраняются продолжительное время. Убедительно доказано, что в этих условиях высокие концентрации катехоламинов и глюкокортикоидов, как медиаторов стресса, активизируют процессы, которые приводят к нарушению жизнедеятельности организма (Карпенко, 2005).

Подобные реакции имеют прежде всего защитно-приспособительное значение, но в ряде случаев они становятся одним из ведущих факторов в механизмах возникновения и развития многих заболеваний.

В общебиологическом плане выделяют физические, химические, биологические (метаболические) и эмоционально-психические причины стресса, которые реализуются у животных в зависимости от великого множества тех или иных экстремальных ситуации, создающих напряжение.

Различают стресс острый, или кратковременный, и хронический (длительный). В случае острого стресса в реакцию защиты вовлекаются уже имеющиеся программы реагирования и мобилизации ресурсов, причем это вовлечение кратковременно. При длительном воздействии стрессогенных факторов происходят перестройки функциональных систем, которые могут повлечь за собой тяжелые последствия для здоровья человека.  При остром стрессе происходит мобилизация программ реагирования, не требующих существенных перестроек регуляторных систем. Преодоление хронического стресса требует существенной перестройки функциональных систем, обеспечивающих необходимый уровень эффективности действий человека (Nicholls, Polman, 2007).

Повторяющиеся стрессы негативно влияют на рост и развитие животных и человека в том числе (Richard, Passwate, 2003). Вместе с тем, умеренное воздействие стресс-факторов может быть полезным, тренирующим, способным обеспечивать высокую резистентность и конституциональную крепость животных и людей (Горбунова, 2008; Карташов, 2001). Большие возможности для исследований воздействия стресса на организм дает изучение физических напряжений причем не только краткосрочных. На психологическом уровне регуляции при хроническом стрессе возрастает «экстернализация» поведения, снижается способность к самостоятельно инициируемым действиям при сохранении устойчивости исполнения действий, регулируемых извне. Источником действия хронического стресса может выступить профессиональный спорт (Schultchen et al., 2019). Как важный ресурс сохранения результативности действий в условиях хронического стресса рассматривается ценностно-смысловая сфера профессионала (Обознов, Полунина, 2011). В то же время необходимый уровень результативности действий может сохраняться за счет сокращения активности с желательного уровня до минимально необходимого (Nicholls, Polman, 2007).

 При чрезмерных нагрузках у спортсменов можно наблюдать последствие в виде психологического выгорания, которое в дальнейшем приводит к изменениям многих компонентов деятельности спортсменов, оказывает отрицательное влияния на организм тренирующегося особенно в спорте высших достижений (Goodger et al., 2007). Ответы на действие психологического выгорания, возникающего при перетренированности и истощения организма при больших физических нагрузках включают физиологические и эмоциональные реакции, в конечном итоге, мобилизирующие защитные силы организма для борьбы с потенциально угрожающей ситуацией, при этом можно наблюдать изменения в поведении, вегетативной функции и секреции многих гормонов, таких, как, например, адренокортикотропный гормон (АКТГ), глюкокортикоиды, минералокортикоиды, катехоламины надпочечников, окситоцин, пролактин и ренин (Goldstein, Kopin, 2007; McEwen, 2007).

Перетренированность связана с огромными нагрузками на организм не только из-за большого объёма работы, но и на фоне быстро меняющихся условий окружающей среды, недовосстановления, принуждения на занятии, психоэмоциональных воздействии и т.п. в ходе интенсивных тренировок или перед соревнованиями (Schultchen et al., 2019; Stults-Kolehmainen, Sinha, 2014).  Вместе с тем реакция на стресс зависит от индивидуальных особенностей стрессоустойчивости и невротических реакций (Украинцева с соавт., 2006; Мамылина с соавт., 2010), которые во многом обусловлены активностью нейромедиаторных систем. (Григорьян, Гуляева, 2015).

Плавание с отягощением может быть примером принудительной нагрузки, которое может вызывать как психологический, так и физический стресс (Moraska et al., 2000). Плавание может вызывать физиологические адаптации, которые могут отражаться в повышении концентрации катехоламинов в плазме, а также в изменении синтеза ферментов биосинтеза катехоламинов у крыс. Что может привести к изменению экспрессии генов серотониновой системы. Данный вид нагрузки можно считать сильным стрессором, который активирует симпатоадреномедуллярную систему и увеличивает синтез гормонов, влияющих на экспрессию генов (Gavrilovich et al., 2012).

Серотонинэргическая система

Серотонинергическая (СТ-ергическая) система - это совокупность взаимосвязанных нейронов, расположенных в ядрах шва ствола мозга, секретирующих в качестве трансмиттера серотонин (5-гидрокситриптамин, 5- Н t) расположенных в переднем (ростральном) и заднем (каудальном) ядрах шва мозгового ствола. Она оказывает тормозное воздействие на мозговые структуры.

Это нейронная система управления работой мозга используя в качестве трансмиттера также серотонин. Серотонинергическая система образована нейронами, тела которых лежат в ядрах шва продолговатого мозга, она тормозит восходящие активирующие системы мозга и тем самым снижает их эффект по активации больших полушарий головного мозга. Т.е. данная система даёт тормозный, успокаивающий эффект.

Кроме того, серотониновая система головного мозга является составной частью нейрональных сетей, обеспечивающих регуляцию эмоционального состояния и настроения. Серотонинергические нейроны образуют группы клеток, расположенные от передней части мезенцефалона до нижних отделов продолговатого мозга (Капай, 2008) Отростки этих клеток широко разветвлены и проецируются на большие области коры переднего мозга, его желудочковую поверхность, мозжечок, спинной мозг и образования лимбической системы.

В головном мозге серотонин обнаруживают в серотонинергических нейронах (рисунок 1), где большинство клеточных тел находятся в ядрах шва ствола мозга, располагаясь в верхних и нижних ядрах шва по средней линии ствола мозга.

 

Рисунок 1. Клеточные тела в ядрах шва ствола мозга

Было обнаружено, что серотонинергическая нейротрансмиссия играет ключевую роль в осуществлении различных физиологических функций. Последние исследования заставили ученых задуматься о роли серотонинергической системы в возникновении психических расстройств. С нарушением экспрессии генов серотонинергической системы связывают развитие психических нарушений, проявляющихся депрессией и тревогой.

Транспортёр серотонина

Особое значение имеет инактивация высвобожденного 5-Нt, где ведущая роль принадлежит транспортеру обратного захвата серотонина – 5-Htt. Транспортёр серотонина - это внутриклеточный белок, являющийся продуктом гена Slc6a4. Он относится к семейству белков-транспортёров моноаминов. Его физиологической функцией является обратный захват и транспорт серотонина из синаптической щели обратно в выделивший его пресинаптический нейрон. Локализованный на пресинаптической мембране серотонинергических нейронов, он выступает регулятором серотонинергической нейропередачи во всем организме, и механизм его действия заключается в поглощении нейротрансмиттера в синапсе (Копытов с соавт., 2012).

Интересно, что многие представляют себе этот белок в качестве свободно находящегося в цитоплазме фермента (вроде моноаминоксидазы), который «цепляет» молекулы серотонина и закачивает их обратно. Такое представление в корне неверно: этот белок заякорен на клеточной мембране, являясь Na/Cl-зависимым транспортёром, переносящим серотонин вместе с ионами натрия внутрь клетки (рисунок 5).

Рисунок 5. Схема движения ионов c помощью переносчика серотонина

5-Htt кодируется геном Slc6a4 (англ. solute carrier family 6 member 4), расположенным на 17-й хромосоме в области q11.1-q12. В ранних исследованиях был найден полиморфизм в промоторной области гена, кодирующего 5-Htt, называемый 5-Httlpr (англ. HTT gene-linked promoter region). 5-Httlpr представлен длинным состоящими из 16 повторов (long, L) и коротким из 14 повторов (short, S) аллелями (Murphy et al., 2004)., различающимися наличием/отсутствием участка из 44 нуклеотидных оснований. Данный полиморфизм (полиморфизм типа «вставка /отсутствие вставки») является функциональным: присутствие длинного аллеля обеспечивает более высокий уровень экспрессии гена и большую интенсивность метаболизма серотонина по сравнению с коротким аллелем, а наличие короткого аллеля локуса 5-Httlpr связано со снижением обратного захвата серотонина, что пролонгирует длительность действия освобожденного серотонина (Копытов с соавт., 2012). Было показано, что S-аллель связан со сниженной экспрессией гена в культуре клеток и с более высокой активностью миндалевидного тела в ответ на эмоциональные стимулы (Dannlowski et al., 2008). Во многих работах показана связь полиморфизма 5-Httlpr с тревожностью, депрессией и биполярным расстройством (Karg et al., 2011), однако только часть исследователей обнаруживает взаимосвязь между серотониновыми транспортерами и тревожностью (Sen et al., 2004), а другие исследователи преимущественно не находят такой взаимосвязи (Schinka et al., 2004).

Дальнейшее изучение гена Slc6a4, кодирующего белок транспортер серотонина, выявило еще один функциональный полиморфизм. Первоначально был найден полиморфный участок 5-Httlpr в промоторной области гена, состоящий из 16 (long, L) или 14 (short, S) повторяющихся элементов, описанный выше. Второй полиморфизм, STin2VNTR, выявлен позже и обусловлен изменением числа тандемных повторов во втором интроне с двумя частыми (10 и 12 повторов) и одним редким (9 повторов) аллелями. Этот полиморфизм выполняет роль аллель-зависимого усилителя экспрессии гена, то есть усиливающий эффект полиморфизма зависит от количества повторов в аллеле, и является разным для аллелей 9, 10 и 12 (Морозова c cоавт., 2013)

Катаболизм серотонина

Серотонин, захваченный из синаптической щели назад в нейрон или глиальную клетку, разрушается с помощью фермента моноаминоксидазы типа А (МАО-А) (рисунок 6), дезаминирующая активность которого у больных психическими расстройствами повышена по сравнению с нормой серотонина (Максимова с соавт., 2007).

Рисунок 6. Катаболизм серотонина

МАО - это митохондриальные ферменты, содержащие флавин, катализирующие окислительное дезаминирование нейромедиаторов и биогенных амидов в головном мозге и периферических тканях. На основании селективности к субстрату и селективности ингибитора были обозначены две формы МАО: МАОА и МАОБ, которые соответствуют двум различным генам. Обычно MAOA катализирует окисление серотонина (5-Ht), тогда как MAOБ действует на 2-фенилэтиламин и бензиламин. Дофамин, норадреналин, адреналин, триптамин и тирамин окисляются обеими формами фермента у большинства видов (Youdim, Bakhle, 2006), тогда как норадренергические нейротрансмиттеры предпочтительно дезаминируются ферментами МАОА. По своему строению эти белки сходны между собой, их аминокислотные последовательности совпадают примерно на 70 %. Т.е. это ферменты, осуществляющие катаболизм моноаминов посредством их окислительного дезаминирования. МАО метаболизирует как эндогенные моноамины — нейромедиаторы и гормоны, так и экзогенные — попадающие в организм с пищей или в лекарствах и психоактивных веществах. Исследования показали, что активность МАО определяется генетически и не изменяется в течение жизни в физиологических условиях. MAO-A и Б кодируются отдельными генами, расположенными на Х-хромосоме. Каждый ген состоит из 15 экзонов с разными коровыми промоторными областями, но с идентичной организацией интрон-экзон, что указывает на то, что MAO-A и Б происходят от дупликации общего предкового гена.

Метаболизм 5-Ht происходит под действием моноаминоксидазы A (MAO-A) с образованием метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) (рисунок 7). Поскольку MAO-A является внутриклеточным ферментом, 5-Ht должен быть поглощен внутри клетки до того, как на него будут воздействовать, и как Sert, так и транспортер норадреналина (Net) способствуют этому поглощению (Stoltenberg et al., 2002). Ткани или клетки, которые вносят значительный вклад в метаболизм 5-Ht, включают клетки легких, кишечника и эндотелия артериальной системы, но любая клетка, которая может принимать 5-Ht и обладает MAO-A, может метаболизировать 5-Ht.

Рисунок 7. Серотонинергический синапс и обращение с серотонином (5-Ht) в результате синтеза, хранения, высвобождения, поглощения и метаболизма.

Рецепторы к серотонину

Поразительная полифункциональность серотонина обусловлена, прежде всего, наличием многочисленных рецепторов, опосредующих воздействие этого медиатора на нейроны (Попова, Науменко, 2010). К настоящему времени с помощью молекулярно-биологических методов выявлено и клонировано 14 различных типов генов и контролируемых ими серотонергических (5-Нt) рецепторов, экспрессирующихся в мозге млекопитающих.

Классификация 5-Н t рецепторов основана на трех принципах:

а) особенностях первичной структуры;

б) механизмах трансдукции сигнала;

в) на фармакологическом профиле (селективные агонисты и антагонисты рецептора).

По этим принципам 5-Нt рецепторы классифицированы в 8 основных типов и 7 подтипов. Большинство 5-Н t рецепторов принадлежат к суперсемейству рецепторов, сопряженных с G -белками (таблица 1).

Каждый из них представляет собой полипептидную цепь, содержащую семь трансмембранных доменов, образующих совместно с внеклеточными петлями и N-концом участок связывания медиатора. Третья цитоплазматическая петля и С-конец осуществляют сопряжение с G-белком. При связывании медиатора происходит изменение конформации рецептора, приводящее к диссоциации G-белка на β-, γ- и α-субъединицы. Эти субъединицы обладают каталитической активностью, благодаря которой способны изменять внутриклеточные процессы.

Таблица 1 - Общая характеристика типов серотониновых рецепторов. (Qi et al., 2014)

Тип	Механизм работы	Эффекты при активации	Генерирующий потенциал
5- H t 1	Gi/G0 -связанный	↓yровня цАМФ	Тормозящий
5-H t 2	Gq/G11 -связанный	↑уровня инозитол-3-фосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG)	Возбуждающий
5-H t 3	Лиганд-зависимый ионный канал, пропускающий натрий и калий	Деполяризация клеточной мембраны	Возбуждающий
5-H t 4	Gs -связанный	↑уровня цАМФ	Возбуждающий
5-H t 5	Gi/G0 -связанный	↓уровня цАМФ	Тормозящий
5-H t 6	Gs -связанный	↑уровня цАМФ	Возбуждающий
5-H t 7	Gs -связанный	↑уровня цАМФ	Возбуждающий
5-H t 8	Метаботропный неуточнённый	↑внутриклеточного уровня кальция	Неизвестно

 

Каждый из типов и подтипов рецепторов характеризуется уникальным контролирующим геном, спектром сродства к разнообразным агонистам и антагонистам серотонина, специфическим распределением в мозге и определенным спектром функций, которые он регулирует. Среди такого разнообразия серотониновых рецепторов привлекает внимание 5-Нt1а подтип. Это обусловлено рядом причин, основными из которых являются:

1) ключевая роль в ауторегуляции 5-Ht системы в мозге (Popova, Naumenko, 2013). 5-Н t 1а рецепторы отличаются от других видов 5-Н t рецепторов тем, что они локализованы как пост-, так и пресинаптически на 5-Н t нейронах, и в зависимости от локализации могут оказывать прямо противоположное действие;

2) экспериментальные данные о вовлечении 5-Н t 1а рецепторов в регуляцию разнообразных форм как нормального, так и патологического поведения;

3) многочисленные данные об участии 5-Н t 1а рецепторов в механизме патологической тревожности и депрессии (Kaufman et al., 2015), подтвержденные клинической эффективностью агонистов 5-Н t 1а рецепторов как анксиолитиков и антидепрессантов;

4) наличие селективных агонистов и антагонистов 5-Нt1а рецепторов. Из-за многообразия функций 5-Н t 1а рецепторов встает вопрос об их генетической и посттранляционной регуляции, связи предрасположенности к патологическому поведению с особенностями генетического контроля, плотности и функциональной активности этих рецепторов. В этом обзоре будут обсуждены данные литературы и собственных исследований, касающиеся генетических подходов к исследованию 5-Н t 1а рецепторов и их участия в регуляции поведения.

Рецепторы типа 5-НТ1

В центральной нервной системе (ЦНС) млекопитающих обнаружены серотониновые рецепторы типа 5-Ht1 и пять их подтипов – a, b, d, e, f, представляющие собой протеины, содержащие 365-422 аминокислотных остатка. Эти рецепторы связаны с ингибиторным G-белком, подавляющим аденилатциклазу, за счёт чего подавляется активность внутриклеточных процессов.

5-Нt1а серотониновый рецептор 5-Нt1а рецептор является эволюционно одним из самых древних. Считается, что он образовался около 800 млн. лет назад, задолго до появления позвоночных животных. Он обнаружен у насекомых (Dacks et al., 2006), плоских червей, круглоротых (Hill et al., 2003) и всех классов позвоночных животных. 5-Нt1а подтип относится к группе рецепторов 5-НТ1 типа, которая также включает в себя 5-Нt1а, 5-Ht1b, 5-Ht1d, 5-Ht1e и 5-Ht1f подтипы, проявляющие от 40 до 63 % структурной гомологии с 5-Нt1а рецептором. Рецепторы 5-Нt1 типа сопряжены с Gi -белком и при активации ингибируют аденилатциклазу – фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ, что является сигналом для активации цАМФзависимых протеинкиназ, которые в свою очередь активируют различные белки (в том числе факторы транскрипции).  Механизм работы 5-Ht1a рецептора изображен на рисунке 8. Активация 5-Н t 1 рецепторов приводит к открытию К⁺ каналов и гиперполяризации мембраны. Имеются данные о том, что активация рецептора 1А подтипа в культурах клеток может приводить к активации фосфолипазы С.

Риcунок 8. Механизм работы 5-Ht1a рецептора

5-Нt1а рецептор представляет собой полипептидную цепь, образующую семь трансмембранных доменов и состоящую из 422 аминокислотных остатков у крысы и 421 – у человека. Этот рецептор характеризуется коротким внутриклеточным С-концом и длинной третьей внутриклеточной петлей, на которой локализован сайт фосфорилирования протеинкиназой С. Была показана связь между фосфорилированием и десенситизацией рецептора, что дало основание полагать, что функция 5-Нt1а рецепторов находится под контролем 5-Н t 2 рецепторов, вторичным посредником которых является протеинкиназа С (Zhang et al., 2001). Кроме того, в третьей цитоплазматической петле имеются два сайта связывания с кальмодулином, связывание которого является сигналом для интернализации рецептора (Turner et al., 2004). Еще одной особенностью структуры рецептора А подтипа является наличие «лейциновых застежек» (leucine zipper), посредством которых, возможно, осуществляются белок-белковые взаимодействия между 5-Нt1а и 5-Нt2 рецепторами. Все эти особенности структуры 5-Нt1а рецептора приоткрывают возможные пути воздействия на его экспрессию, в том числе другими 5-Н t рецепторами. Факторы, влияющие на экспрессию рецептора, могут, по-видимому, действовать и на уровне транскрипции. В 1999 году была описана структура промотора гена 5-Нt1а рецептора. Было показано, что основной сайт инициации транскрипции локализован в положении –967 п. н. от стартового кодона AUG. У крыс этот сайт ассоциирован с выше расположенными TATA-боксами, однако у мышей TATA-боксы отсутствуют. Принимая во внимание сходство этих животных в экспрессии рецептора и ее регуляции, авторы предположили, что TATA-боксы не играют существенной роли в регуляции транскрипции гена 5-Нt1а рецептора. Кроме того, в промоторе было обнаружено наличие селективного энхансера (enhancer) (между –426 и –117 п.н.), неселективного (между –1519 и –426 п.н.) и сильного селективного сайленсера (silencer) (между –1590 и –1519 п.н.) (Ou et al., 2000). Из этих элементов наиболее интересным является сайленсер, поскольку в случае его делеции транскрипция гена усиливается более чем в 10 раз. Поэтому было предположено, что регуляция экспрессии гена 5-Нt1а рецептора на уровне транскрипции осуществляется, вероятно, в основном за счет репрессии (Ou et al., 2001). Таким образом, наряду с генетическим контролем интенсивности синтеза 5-Ht1а рецепторов существуют и другие уровни регуляции их функциональной активности.

В последние годы к выявленным ранее механизмам регуляции 5-Нt1а рецептора добавлены новые, связанные с олигомеризацией и взаимодействием 5-Нt рецепторов. Было установлено, что 5-Нt1а рецептор существует в мозге в нескольких формах: как 5-Нt1а мономер, 5-Нt1а / 5-Нt1а гомодимер и гетеродимер, связанный с другими рецепторами (Woehler et al., 2009; Kobe et al., 2012; Renner et al., 2012).

Новые данные о роли димеризации в регуляции функциональной активности 5-Нt1а рецептора получены при изучении взаимодействия 5-Нt1а и 5-Нt7 рецепторов (Renner et al., 2012; Popova, Naumenko, 2013; Naumenko et al., 2014). Оказалось, что гетеродимер 5-Нt1а/5-Н t 7, не оказывая влияния на функциональные свойства 5-Нt7 рецептора, модулирует два основных фактора десенситизации 5-Нt1а рецепторов: ослабляет их функциональную активность и увеличивает интенсивность интернализации. Таким образом, ключевой регулятор 5-Н t системы мозга, 5-Нt1а рецептор, сам зависит от 5-Нt7 рецепторов, которые, образуя с ним димерные комплексы, ведут к функциональной инактивации. Это совершенно новая и важнейшая роль 5-Н t 7 рецептора и его взаимодействия (cross-talk) с 5-Нt1a рецептором позволяет по-новому взглянуть на проблему механизма депрессии и действия антидепрессантов группы ингибиторов обратного захвата серотонина.

Рецепторы типа 5-Н t 2

В отличие от первого типа, они являются возбуждающими. Рецепторы 5-Нt2 увеличивают чувствительность нейрональной мембраны к стимулам. Они уменьшают поступление ионов калия (К⁺) в клетку и облегчают посредством данного эффекта возникновение деполяризации, в этом отношении они оказывают эффект, противоположный 5-Нt1 -рецепторам. Механизм работы 5-Нt2а-рецептора изображен на рисунке 9.

Рисунок 9. Механизм работы 5-Н t 2а -рецептора

 При активации рецептора бета- и гамма-субъединицы «высвобождают» Gq -субъединицу, активирующую фосфолипазу С (PLC), которая, в свою очередь, превращает фосфатидилинозитолбисфосфат (PIP2) в диацилглицерол (DAG) и инозитолтрифосфат (IP3). DAG активирует протеинкиназу С (PKC), а IP3 запускает кальмодулин-зависимый механизм высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума.

Существуют также побочные биохимические пути, связанные с образованием арахидоновой кислоты из DAG. «Выбор» пути, по которому будут работать вторичные мессенджеры, может также зависеть от лиганда: например, если рассматривать DOB и 2C-B, то DOB (за счёт наличия метильной группы в альфа-положении на боковой цепи) действует по «основному» пути, описанному выше, а 2C-B – по «альтернативному», ведущему к повышению концентрации арахидоновой кислоты.

5-Нt3 -рецептор.

Данный вид рецепторов является уникальным в своём роде – это единственный неметаботропный тип. 5-Нt3 -рецептор представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, состоящий из пяти различных субъединиц (5- Ht 3 a, 5- Ht 3в, 5- Ht 3с, 5- Ht 3 d, 5- Ht 3 e). Он может быть представлен в виде гомопентамера, состоящего исключительно из одних 5-Нt3а -субъединиц, либо гетеропентамера – когда в его составе, помимо обязательно наличествующей 5-Нt3а -субъединицы, находятся субъединицы других подтипов. Интересно, что по уровню гомологии субъединицы можно разделить на 2 группы: первая включает в себя 5- Ht 3 a и 5- Ht 3в, вторая 5- Ht 3с, 5- Ht 3 d и 5- Ht 3 e.

Каждая субъединица состоит из четырёх участков(М1-М4), представляющих собой аминокислотную цепь, уложенную в форме альфа-спиралей, которые пересекают клеточную мембрану. N-конец аминокислотной цепи субъединицы локализован на внешней стороне клеточной мембраны и осуществляет связывание лигандов, трансмембранные участки (а конкретнее – аминокислотная петля, связывающая М2 и М3-участки) непосредственно задействованы в механизме открытия ионного канала. Также присутствует внутриклеточная петля между М3 и М4-участками, участвующая в транспортировке и регуляции работы субъединицы. Механизм работы 5-Нt3 -рецептора изображен на рисунке 10.

Рисунок 10. Механизм работы 5-Нt3 -рецептора.

Данный ионный канал пропускает только положительно заряженные ионы (натрий, калий, небольшие количества кальция), что вызывает деполяризацию и возбуждение нейрона при его активации.

5- Ht 3 рецептор оказывает стимулирующее влияние на функцию GABA-ергических нейронов в гиппокампе и новой коре головного мозга. Потому что GABA является ингибирующим нейротрансмиттером, что приводит в итоге к уменьшению его активности. Нейрофизиологические свойства указывают на то, что сам 5-Нt3 -рецептор не является G-белок-связанным рецептором. Активность ионного канала регулируется ионами кальция и магния (Ca2+ и Mg 2+).