Определение билирубина в сыворотке крови по методу иендрашика в модификации левченка В. И. И влизла В. В.

       Принцип. Диазореактив, который образуется при взаимодействии сульфаниловой кислоты с натрием азотнокислым, реагирует с билирубином сыворотки крови, образуя комплекс розово-фиолетвого цвета. Конъюгированный (прямой) билирубин дает быструю реакцию, а свободный (неконъюгированный) – только после добавления кофеинового реактива.

       Реактивы. 1. 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, чда;

       2. Кофеиновый реактив: 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензойнокислого и 12,5 г натрия уксуснокислого растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50-60 ⁰С, перемешивают;

       3. Диазосмесь: готовят смешением деазореактивов А и Б.

       Деазореактив А: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл дистиллированной воды, добавляют 15 мл концентрированной серной кислоты. После полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствора доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стоек, хранить в посуде из темного стекла;

       Деазореактив Б: 0,5 %-ный раствор натрия азотнокислого (хч), хранить в посуде из темного стекла 2-3 недели;

       Непосредственно перед работой смешивают 10 мл деазореактива А и 0,3 мл деазореактива Б.   

Оборудование. Фотоэлектроколориметр, водяная баня, мерные колбы, пипетки на 1 и 2 мл, пробирки.

       Ход определения. В четыре пробирки вносят по 0,5 разведенной вдвое сыворотки крови. Первая пробирка является контролем для определения общего билирубина. В нее добавляют 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида и 1,75 мл кофеинового реактива. Во второй пробирке определяют содержание общего билирубина: вносят 0,25 мл диазореактива и 1,75 мл кофеинового реактива. Третья пробирка – контроль для определения прямого (конъюгированного) билирубина. В нее вносят 2 мл изотонического раствора натрия хлорида. В четвертую пробирку добавляют 1,75 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,25 мл диазосмеси.

       Конъюгированный билирубин определяют через 5 мин после добавления диазосмеси, общий – через 20 мин при длине волны 560 нм в кювете с оптическим путем 5 мм против дистиллированной воды. От показателей экстинкции проб для определения общего и связанного билирубина отнимают показатели соответствующих контролей и по калибровочному графику определяют фактическое содержание данных параметров. Построение калибровочных графиков производят с помощью реактивов выпускаемых фирмами «Филисит» и «Реагент».

       Клиническое значение. Увеличение концентрации билирубина в сыворотке крови – гипербилирубинемия наблюдается при болезнях, которые сопровождаются гемолизом эритроцитов (за счет свободного билирубина): пироплазмозы, отравление гемолитическими ядами, лептоспироз. Увеличение содержания связанного билирубина отмечается при механической желтухе. Одновременное повышение обоих фракций билирубина - при паренхиматозной желтухе.

 Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ)и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) по методу Рейтмана-Френкеля.

Принцип. Вследствие переаминирования, что происходит под действием АлАТ и АсАТ, образуется щавелевоуксусная и пировиноградные кислоты, которые при добавлении 2,4-динитрофенилдигразина образуют в щелочной среде окрашенные гидразоны.

Реактивы. 1. Субстратный раствор АлАТ (или АсАТ), чда: буфер 0,1 моль/л рН 7,4±0,2; 2-оксоглутарат – 2 ммоль/л; DL-аланин (для АлАТ) или DL-аспартат (для АсАТ) – 0,2 моль/л 105 мл;

2. 2,4-динитрофенилдигразин, чда (1 ммоль/л в 1 моль/л соляной кислоты – 105 мл;

3. Стандартный раствор пирувата, чда (2 ммоль/л) – 3 мл;

4. 0,4 М (16 г/л) раствор едкого натра или 0,4 М (22,4 г/л) раствор едкого кали, чда.

Возможно применение набров реактивов НПФ «Филисит» и «Реагент».

Оборудование. Фотоэлектроколориметр, водяная баня или термостат, пипетки на 0,1; 1 и 5 мл, пробирки.

Ход определения. В пробирку вносят 0,25 мл субстатного раствора АлАТ (АсАТ) и инкубируют при температуре 37 ⁰С 3 мин, затем добавляют 0,05 мл сыворотки крови и нагревают при той же температуре точно 60 мин. Затем внсят 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилдигразина и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Определяют оптическую плотность при длине волны 500-560 нм в кювете с толщиной 10 мм против контроля. Контролем выступает 0,05 мл изотонического раствора, который обрабатывается аналогичным образом.

Расчет активности ферментов проводят по калибровочному графику. Его построение приведено в таблице

 

№ пробирки	Стандартный раствор натрия пирувата, мл	Изотонический раствор натиря хлорида, мл	Субстратный раствор	Активность фермента
				ммкат/л	мкмоль/час×мл
^1	^0,05	^0,1	^0,45	^0,28	^1,0
^2	^0,1	^0,1	^0,4	^0,56	^2,0
^3	^0,15	^0,1	^0,35	^0,83	^3,0
^4	^0,2	^0,1	^0,3	^1,11	^4,0
^5 (контроль-ная проба	^-	^0,1	^0,50	^-	^-

Клиническое значение. АсАТ и АлАТ находятся во многих клетках организма. Определение их активности используют при диагностике болезней печени. Максимальное увеличение активности данных ферментов наблюдается при некрозе печени, остром паренхиматозном гепатите. При хроническом гепатите, а так же при гепатодистрофии отмечают менее выраженный подъем их активности. Для КРС более информативным является определение АсАТ, для мелких животных – АлАТ и АсАТ.