Обнаружение белков в гидролизатах кости и тканей зуба

Принцип метода

При гидролизе белкового компонента кости, тканей зуба образуются фрагменты белков и свободные пептиды, вступающие в характерную биуретовую реакцию, когда пептидные связи в щелочной среде формируют с ионами меди комплексное соединение фиолетового цвета.

Проведение анализа

Для гомогенизации образцов твёрдых тканей и приготовления гидролизата измельчают поотдельности небольшой кусочек кости и небольшой кусочек зуба, затем в отдельных ступках тщательно растирают оба образца до гомогенного порошкообразного состояния. С помощью сухой воронки полученный порошок костной ткани переносят в 1-ю пробирку, порошок тканей зуба переносят во 2-ю пробирку. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 10 % раствора NaOH, перемешивают, закрывают фольгой, помещают в кипящую водяную баню, нагревают до кипения и прогревают 1 мин. Белки при этом подвергаются щелочному гидролизу. Гидролизаты охлаждают под проточной водой и после охлаждения проводят качественную реакцию на белковый компонент: в пробирки к гидролизату костной ткани и к гидролизату тканей зуба добавляют по 1 капле раствора CuSO₄. Появление фиолетового окрашивания, характерного для биуретовой реакции, указывает на наличеи белка в исходном субстрате.

Оформление работы

Фиксируют принципы методов, результаты реакций, сравнивают полученные данные с теоретическими предпосылками, делают заключение о наличии минеральных составляющих и белковых веществ в костной ткани и тканях зуба.

Лабораторная работа 2.
Определение концентрации кальция в сыворотке крови и моче

Актуальность

Биологическое значение кальция очень разнообразно. Он участвует в формировании костей, зубов, хрящей, влияет на проницаемость биологических мембран, нервно-мышечную возбудимость и проводимость, участвует в сокращении и расслаблении сердца и скелетной мускулатуры, секреторных процессах, воздействует на обмен веществ, является посредником действия гормонов и важным фактором свёртывания крови.

Концентрация кальция в плазме крови отражает его содержание в организме и состояние костной ткани. Гипокальциемия приводит к нарушению минерализации костей, поскольку в этом случае кальций начинает вымываться из депо, каковым для кальция в организме является скелет. Минерализованные ткани зуба также вовлекаются в этот процесс. Одновременно нарушается реминерализация эмали вследствие влияния концентрации кальция в плазме крови на содержание кальция в слюне.

Реактивы

1) 4 % раствор щавелевокислого аммония, 2) 2 % раствор аммиака,
3) 0,5 М раствор Н₂SО₄, 4) 0,01 М раствор марганцевокислого калия,
5) рабочий реагент, содержащий арсеназо‑III в ацетатном буфере,
6) 2,5 ммоль/л стандартный раствор кальция углекислого.

Материал для исследования

1) Сыворотка крови, 2) свежая моча.

Титрометрический метод

Принцип метода

Метод основан на осаждении кальция из сыворотки крови в виде оксалата кальция. Оксалат кальция разлагается серной кислотой при нагревании с образованием щавелевой кислоты, которую оттитровывают перманганатом калия. Содержание кальция пропорционально количеству щавелевой кислоты.

СаCl₂ + (NH₄)₂C₂O₄ → CaC₂O₄ + 2NH₄Cl

CaC₂O₄ + H₂SO₄ → H₂C₂O₄ + CaSO₄

5H₂C₂O₄ +2KMnO₄ + 3H₂SO₄ → 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 8H₂O +10CO₂

Проведение анализа

В центрифужную пробирку приливают 1 мл сыворотки крови и 1 мл дистиллированной воды (опыт), в другую центрифужную пробирку ‑ 2 мл дистиллированной воды (контроль). В обе пробирки добавляют по 0,5 мл раствора щавелевокислого аммония, слегка встряхивают и инкубируют при комнатной температуре 30 мин, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. В опытной пробирке на дне остаётся белый осадок оксалата кальция. В обе пробирки наливают по 2 мл раствора аммиака для удаления избытка щавелевокислого аммония. Затем пробирки вновь центрифугируют в течение 5 мин и повторно удаляют надосадочную жидкость. В обе пробирки вносят по 1 мл раствора серной кислоты для растворения осадка, слегка размешивают стеклянной палочкой и помещают в нагретую водяную баню на 2 мин. Содержимое пробирок титруют раствором перманганата калия до появления слаборозовой окраски, не исчезающей в течение минуты.

Расчёт

Расчёт содержания кальция в пробе проводят по формуле:

Ca = (А – Б) · 0,005 · 1000,

где: Са ‑ концентрация кальция в сыворотке крови, ммоль/л, А ‑ объём раствора КМnО₄, пошедший на титрование опытной пробы, мл;

Б ‑ объём раствора КМnО₄, пошедший на титрование контроля, мл;

0,005 ‑ количество Са, соответствующее 1 мл 0,01 М КМnО₄, моль;

1000 ‑ коэффициент для пересчёта на 1 л сыворотки крови.

Колориметрический метод

Принцип

В кислой среде ионы кальция образуют с индикаторным реактивом арсеназо‑III комплекс малинового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция в пробе и определяется колориметрически.

Проведение анализа

Готовят три пробы согласно таблице:

	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл	Контроль, мл
Сыворотка Моча Стандартный раствор Рабочий реагент	0,02 ‑ ‑ 2,0	‑ 0,02 ‑ 2,0	‑ ‑ 0,02 2,0
	Пробы перемешивают, измеряют оптическую плотность проб против воды в кювете 0,5 см при длине волны 650‑670 нм (красный светофильтр)

Расчёт

Содержание кальция в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

 ,

где: С_ОП – концентрация кальция в сыворотке крови (ммоль/л),
С_СТ ‑ концентрация кальция в стандартном растворе (ммоль/л),
Е_ОП ‑ экстинкция опытной пробы, Е_СТ ‑ экстинкция стандарта.

Содержание кальция в моче рассчитывают по формуле:

 _· Д,

где: С_ОП ‑ концентрация кальция в моче (ммоль/сут), С_СТ ‑ концентрация кальция в стандартном растворе, Е_ОП ‑ экстинкция опытной пробы, Е_СТ ‑ экстинкция стандарта, Д ‑ диурез (1300‑1500 мл/сут).

Нормальные величины

Сыворотка	2,0–2,6 ммоль/л
Моча	2,5–7,5 ммоль/сут

Практическое значение

Содержание общего кальция в крови повышается при избытке паратгормона, гипервитаминозе D, идиопатической чувствительности к витамину D, деструкциии костей, злокачественных опухолях с поражением костной ткани и без такового, тиреотоксикозе, акромегалии, лейкозах, миеломной болезни, ацидозе. Гипокальциемия выявляется при гиповитаминозе D (недостаток всасывания, реабсорбции и резорбции кальция), нарушении всасывания, недостаточности паратгормона, остром панкреатите, гипотиреозе, хронической почечной недостаточности, прогрессирующей остеомаляции, сепсисе (выход через нарушенную систему микроциркуляции), алкоголизме, циррозе печени, гипоальбуминемии, остром алкалозе (усиление связывания кальция с белками). Кальцитонин снижает содержание кальция в крови, ограничивая резорбцию костной ткани.

Содержание кальция в моче возрастает при метастазах рака или саркомы в кости и при состояниях организма, сопровождающихся гиперкальциемией. Снижение уровня кальция в моче отмечается во всех случаях снижения его содержания в сыворотке, при нефрозах, остром нефрите, дефиците витамина D.

Оформление работы

Указывают принцип метода, фиксируют результаты, делают расчёты, формулируют вывод о содержании Са в сыворотке крови и моче, наличии/отсутствии патологических отклонений, отмечают клинико-диагностическое значение.

Лабораторная работа 3.
Определение концентрации неорганических фосфатов
в сыворотке крови и моче

Актуальность

Обмен фосфора тесно связан с обменом кальция, что особенно важно для поддержания функционирования костной и зубных тканей. Для диагностики патологических состояний существенное значение имеет установление соотношения между содержанием кальция и неорганических фосфатов в крови (норме они соотносятся как 2: 1).

Уровень фосфатов в крови зависит от функции паращитовидных желёз, содержания соматотропина и вазопрессина, от регулирующего действия витамина D и функции почек. Для поддержания кальций-фосфорного обмена очень важен процесс выведения этих минералов из организма, осуществляемый преимущественно почками и имеющий неоднозначную гормональную регуляцию. Потеря фосфатов с мочой может превалировать над выведением кальция.

Принцип метода

Фосфорная кислота безбелкового фильтрата сыворотки крови (мочи) реагирует с ванадатом и молибдатом аммония с образованием фосфорнованадиево-молибденовой кислоты жёлтого цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации неорганического фосфата в пробе и определяется фотометрически.

Реактивы

1) 10% трихлоуксусная кислота, 2) рабочий раствор, содержащий 1 ммоль/л аммония молибдата и 1 ммоль/л аммония ванадата, 3) 2,5 ммоль/л стандартный раствор KH₂PO₄.

Материал для исследования

Сыворотка крови, моча (разведение 1: 5).

Проведение анализа

Сначала готовят безбелковый фильтрат сыворотки крови (мочи) в центрифужных пробирках, вторую часть работы проводят с надосадочной жидкостью (фильтратом) в химических пробирках

Реагенты	Опыт 1	Опыт 2	Стандарт
Сыворотка Моча, разведение 1: 5 Стандартный раствор Дистилл. вода ТХУ	0,2 – – 0,6 0,8	– 0,2 – 0,6 0,8	– – 0,2 0,6 0,8
	Перемешивают, через 5‑8 мин фильтруют или центрифугируют 10 мин при 1500–2500 об/мин
Супернатант Рабочий раствор	0,8 1,0	0,8 1,0	0,8 1,0
	Перемешивают, инкубируют 20 мин, измеряют оптическую плотность опытных проб и стандарта против воды при длине волны 670 нм (красный светофильтр)

Расчёт

Содержание фосфатов в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

 ,

где: С_ОП – концентрация фосфатов в сыворотке крови (ммоль/л),
С_СТ ‑ концентрация фосфатов в стандартном растворе (2,5 ммоль/л),
Е_ОП ‑ экстинкция опытной пробы, Е_СТ ‑ экстинкция стандарта.

Содержание фосфатов в моче рассчитывают по формуле:

 _· 5 _· Д,

где: С_ОП ‑ концентрация фосфатов в моче (ммоль/сут), С_СТ ‑ концентрация фосфатов в стандартном растворе, Е_ОП ‑ экстинкция опытной пробы, Е_СТ ‑ экстинкция стандарта, 5 ‑ разведение мочи, Д ‑ диурез (1300‑1500 мл/сут).

Нормальные величины

Сыворотка		0,81‑1,48 ммоль/л
Моча		25,8‑48,4 ммоль/сут

Практическое значение

Концентрация неорганических фосфатов в сыворотке крови и моче, прежде всего, зависит от функции паращитовидных и щитовидных желез, функции почек, регулирующего влияния кальцитриола.

Гиперфосфатемия наблюдается при почечной недостаточности, гипертиреозе, гипопаратиреоидизме, акромегалии, заживлении костных переломов, метастазах в кости, передозировке витамина D, остром дыхательном ацидозе, миеломной болезни. Гипофосфатемия отмечается при инфузии глюкозы и гиперинсулинизме (инсулин способствует транспорту фосфора в клетки), диабетическом кетоацидозе (глюкозурия повышает экскрецию фосфатов с мочой), гипокалиемии, гиперпаратиреозе, микседеме, рахите, остеомаляции, остром алкоголизме, синдроме мальабсорбции, пеллагре.

Выделение фосфатов с мочой возрастает при ускорении катаболических процессов в организме – гипертиреоз, менингит, диабетический кетоацидоз, лейкоз, нарушение функции почек. Снижение концентрации в моче отмечается при туберкулезе, гипофункции паращитовидных желез.

Оформление работы

Указывают принцип метода, фиксируют результаты исследования, делают расчёты, отмечают диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии. Полученные на занятии результаты содержания кальция и фосфатов в биологических жидкостях оценивают, используя заполненную таблицу 2 (см. задания для контроля усвоения темы). Обсуждают роль гормональной регуляции (кальцитриол, паратирин, кальцитонин), синергизм и антагонизм действия гормонов в обмене Са и фосфатов, значение для здоровья костной и зубных тканей.

Лабораторная работа 4.
Определение активности щелочной фосфатазы
в плазме крови и ротовой жидкости

Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) – фосфогидролаза моноэфиров фосфорной кислоты. У щелочной фосфатазы (ЩФ) различают 5 тканеспецифичных изоферментов: костный, кишечный, почечный, плацентарный, печеночный. Наиболее высокая активность фермента обнаружена в остеобластах, эпителии тонкого кишечника и канальцев почек, предстательной и молочной железах, плаценте, печени. Фракции ЩФ распределены в организме неравномерно, отличаются по каталитическим свойствам, подвижности при электрофорезе, устойчивости к тепловой инактивации. Изоформы ЩФ высвобождают неорганический фосфат из органических соединений (фосфоэтаноламин, пиридоксаль-фосфат, b‑глицерофосфат, пирофосфат и др.) путём гидролиза.

R–O–PO₃^2– + H₂O  R–OH + HPO₄^2–

Щелочная фосфатаза, выходя из клеток в плазму крови, образует комплексы с белками и липидами.

Принцип метода

Метод основан на способности щелочной фосфатазы гидролизовать фосфоэфирную связь в субстрате (пара‑нитрофенилфосфат) с освобождением пара‑нитрофенола, дающего в щёлочной среде жёлтое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна активности фермента и определяется колориметрически после остановки ферментативной реакции ингибитором.

Необходимые реактивы

1) Субстратно-буферный раствор для определения активности щелочной фосфатазы, рН 10,5 (готовят перед занятием), 2) раствор 4‑нитрофенилфосфата (раствор субстрата), 3) буферный раствор, 4) стандартный раствор пара‑ нитрофенола, 5) 0,02 N раствор NаОН, 6) раствор ингибитора.

Материалы для исследования

Смешанная слюна, плазма крови.