Методы диагностики в микробиологии бактериоскопические, бактериологические, серологические, аллергологические, биологические, генетические.

К методам исследования любых микроорганизмов относят:

1.микроскопия: световая, фазово-контрастная, темнопольная, флуоресцентная, электронная;

2.культуральный метод;

3.биологический метод (заражение лабораторных животных с воспроизведением инфекционного процесса на чувствительных моделях);

4.молекулярно-генетический метод (ПЦР, ДНК- и РНК-зонды и др.);

5. аллергологические. Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, с внутрикожным введением Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, токсоплазмоз, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.

6.серологический метод — выявления в крови антигенов микроорганизмов или антител к ним (ИФА). Необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем, исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток. AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго. Определение классов Ig характеризует этапы инфекционного процесса.

Особое значение имеют методы выявления микробных Аг, которые появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Для классификации и идентификации м\о используют определение генетического родства в последовательности расположения нуклеиновых кислот в геноме бактериальной клетки, чаще ДНК. при помощи реакции ПЦР.

ПЦР изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Через 8 лет после этого за изобретения метода ПЦР он получил Нобелевскую премию.

Это метод является «золотым стандартом» и позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуального определения. При этом происходит копирование только того участка, который присутствует в исследуемом образце.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода высока чрезвычайно. Эффективность достигает 100%

С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов, но это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар нуклеоидов.

Сущность ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают нагреванию до 90 – 940С на 0,5 – 2 минуты, что ведет к денатурации – разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали (цепи ДНК расходятся), а затем охлаждают до 52⁰С в присутствии праймера ( затравки для инициации реакции), фермента ДНК – полимеразы Затем снова повышают температуру до 70 – 72⁰С, что приводит к синтезу новой ДНК, комплементарной матричной.

Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не синтезируется достаточное количество копий ДНК для идентификации или дальнейших исследований. В среднем проводят 80 циклов синтеза новой ДНК. Один цикл длится в среднем 3 минуты), что занимает 3 часа – за это время образуется около 1 млн. молекул копий.

Недостатки метода. ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что в помещении должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью 99,9%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание».

Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии явной клинической картины. Одна из возможных причин – материал для исследования был взят некачественно.

 

 

Лекция