Основы гистологической техники.

Для приготовления гистологических препаратов взятые кусочки тканей и органов должны пройти следующие этапы проводки: 1 - взятие материала, 2 - фиксация, 3 - промывание, 4 - обезвоживание материала, 5 - уплотнение, 6 - изготовление срезов, 7 - окрашивание срезов, 8 - обезвоживание, 9 - просветление, 10 - заключение.

1. Взятие материала. Для приготовления гистологических препаратов материал берут от животных, умерщвленных для этой цели, от животных и людей во время операции (биопсия) и от трупов.

2. Фиксация проводится для сохранения прижизненной структуры ткани и кусочков органов путем быстрой коагуляции ее белков. Различают простые фиксаторы (чаще всего 10% формалин) и сложные (смесь Ценкера, Буэна, Мюллера и др.). Вырезанный кусочек или орган следует тотчас же опускать в заранее приготовленную фиксирующую жидкость. Количество фиксирующей жидкости должно в 20-30 раз превосходить объем кусочка. Срок фиксации тканей в формалине 24-48 часов. В большинстве случаев фиксация производится при комнатной температуре. Размер исследуемых кусочков должен быть не более 1×1 см. Фиксирующие растворы следует готовить непосредственно перед их употреблением.

3. Промывание. По окончании фиксации объектыпромывают водой для удаления фиксатора и артефактов. Промывка длится до 1-2 суток.

4. Обезвоживание материала. При этом взятые кусочки тканей последовательно обрабатывают спиртом возрастающей концентрации (70 %, 80 %, 96 %, 100 %) в каждом растворе по 24 часа. Вслед за обезвоживанием в спиртах следует заливка материала в специальные плотные среды (парафин).

5. Уплотнение. Схема заливки в парафин:

1. Обезвоживание в спиртах 70 %, 80 %, 96 % и абсолютный спирт по 24 часа в каждом.

2. Погружение объекта в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 1-3 часа.

3. Перенос объекта в чистый ксилол на 3 часа.

4. Погружение в раствор парафина в ксилоле при температуре
37 градусов на 2 часа.

5. Перенос в 1-й чистый парафин на 2 часа при температуре термостата 56 градусов.

6. Перенос во 2-й чистый парафин на 1-2 часа при 56 градусов.

7. Заливка материала чистым парафином в бумажных формочках.

8. Наклеивание на деревянные кубики.

6. Изготовление срезов производится на санном микротоме толщиной 7-10 мкм. Предварительно предметные стекла очищают от грязи и обезжиривают их поверхность. Для того чтобы парафиновые срезы можно было подвергнуть дальнейшей обработке, их необходимо наклеить на предметное стекло в расправленном положении. Клеевой основой для предметных стекол служит белок куриного яйца с глицерином в равных количествах по объему. Предварительно срезы переносят в теплую воду для расправления, затем смазанное белком с глицерином предметное стекло подводят в наклонном положении под плавающий срез.

7. Окраска препаратов. Различная кислотность субстрата клетки обеспечивает избирательное отношение частей клетки к красителям. Структуры, имеющие кислую реакцию, обладают сродством к основным красителям, поэтому их называют базофильными (базофильны ядра клеток, цитоплазма белоксинтезирующих клеток). Свойство окрашиваться основными красителями – базофилия. Структуры, щелочной реакцией обладают сродством к кислым красителям (оксифилия) и называются оксифильными (цитоплазма большинства клеток, волокна межклеточного вещества). Окраска гематоксилин - эозином наиболее распространенный метод окрашивания срезов. Гематоксилин окрашивает ядро в синий цвет, тогда как эозин окрашивает цитоплазму в красный цвет. Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева. Эозин – искусственная краска.

Схема окраски гематоксилин-эозином парафиновых срезов:

- Срезы, подлежащие окраске, нужно освободить от пропитывающего их парафина в 2-х порциях ксилола – 4-5 мин.

- Удалить из срезов ксилол в 100 градусном спирте – 2-3 мин.

- Выдержать срезы в 96 % спирте – 2-3 мин.

- Выдержать срезы в 70 % спирте – 2-3 мин.

- В воде дистиллированной – 1-2 мин.

- Окраска гематоксилином – 3-5 мин.

- Сполоснуть в водопроводной воде.

- Окрасить эозином – 1 мин.

- Промыть в воде.

8. Обезвоживание окрашенных срезов в спиртах возрастающей крепости по 1-2 мин.

9. Просветление в ксилоле 1-2 мин.

10. Заключение. Осуществляется путем нанесения бальзама на срез и осторожным покрытием препарата покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для изучения.