Определение остаточных количеств антибиотиков в молоке.

Согласно Федерального закона РФ от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию", в молоке-сырье не допускается содержание антибиотиков 4-х групп – левомицетина (хлорамфеникола), тетрациклина, пенициллина и стрептомицина.

Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия - аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передача резистентных форм микробов.

Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т.п.

 

Ускоренный метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах (утвержден Министерством здравоохранения 29 марта 1995 г.) Метод основан на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде. Дегидрогеназы-ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки. Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления повреждающего действия антибиотика на различные тест-культуры микроорганизмов. В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тест-культур лишаются такой возможности, и метиленовый синий не восстанавливается. Метод состоит из нескольких этапов: 1. Подготовка проб к исследованию. 2. Получение и хранение взвеси клеток тест-культур. 3. Определение "рабочей дозы" тест-культур. 4. Определение концентрации антибиотиков и расчет активности. 5. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом продукте 1. Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами помещают в водяную баню с температурой 60±1°C.Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания - 30 мин - отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки. Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, пробы, подготовленные к исследованию, в количестве 10 мл вносят в колбы емкостью 50 мл и добавляют равное количество (10 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: при определении тетрациклина - цитратно-солянокислый буфер N2; стрептомицина или пенициллина фосфатный буфер N4 и N1 соответственно. Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в 2 раза.2. Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Вас.subtilis, вар. 6633; Вас.subtilis, вар.L2; Вас.mycoides 537;  Micrococcus luteum ATCC 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам. Для определения пенициллина и стрептомицина предпочтительно пользоваться спорообразующими тест-культурами: Вас.subtilis, вар.6633; Вас.mycoides 537 u Micrococcus luteumATCC 9341; для тетрациклина - Вас.subtilis, вар.L2.Вначале тест-культуру рассевают на чашки с 2%-ным мясо-пептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят в термостат при температуре 37±1°C на 20±3 ч. После чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2%-ным мясо-пептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре 37±1°C на 20±3 ч.Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре 4±1°C не более 7 дней.3. Полученную взвесь тест-культур титруют путем последовательных двукратных разведений в объеме 1 мл питательного бульона. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают в термостат при температуре 37±1°C 3 ч. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и охлажденного до температуры 45±1°C 1%-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1%-ный питательный агар из расчета: на 100 мл среды 0,4 мл 0,5%-ного водного раствора метиленового синего и 1 мл 40%-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре 37±1°C в течение 1-2 ч, после чего учитывают результат (табл.16). Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается.Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за "рабочую дозу". Функциональная активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение 1 недели.Таблица 16 Определение "рабочей дозы" тест-культур

Тест-культуры	Время, часов	Учет интенсивности клеточного дыхания
		Разведения тест-культур
		1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024
B.subt., вар.6633	1	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-
B.subt., вар.L2	1	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
B.mycoides 537	1	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-
Micrococcus luteum ATCC 9341	1	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-

Обозначения: знак плюс (+) - полное обесцвечивание метиленового синего, знак минус (-) - отсутствие обесцвечивания.Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через 1 ч инкубации в термостате при 37 С, принимают за "рабочую дозу". В среднем, "рабочая доза" тест-культур определяется у:- Вас.subtilis, вар.6633                 в разведении 1:256- Вас.subtilis, вар.L2                    в разведении 1:512- Вас.mycoides 537                       в разведении 1:128- Micrococcus luteum ATCC 9341 в разведении 1:64 4. Количественное определение концентрации антибиотиков и расчет активности.При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют в 1 мл соответствующего буфера, получая, таким образом, основной раствор стандарта 1000 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл и т.д.), разводят соответствующими буферными растворами. Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5 мл мясо-пептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1ч. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37±1°C на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком.Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при температуре 37±1°C в термостате. Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (-синий). О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 ч инкубации в термостате при температуре 37±1°C по сравнению с контролем. 5. Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина и тетрациклина. Приготовление стандарта бензилпенициллина Во флакон, содержащий 500000 ЕД натриевой соли бензилпенициллина товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М фосфатного буфера pH 7,0. Концентрация исходного раствора пенициллина составляет 50000 ЕД/мл. Далее получают 5000 ЕД/мл, разводя этот раствор в 10 раз. К 1 мл этого раствора прибавляют 4 мл 0,066 М фосфатного буфера, pH 7,0. Получают основной раствор пенициллина - 1000 ЕД/мл. Затем разводят десятикратно 0,066 М фосфатным буфером, pH 7,0 до 100 и 10 ЕД/мл. После этого 0,5 мл последнего разведения, т.е. 5 ЕД/мл добавляют в 1-ю пробирку с заранее разлитым по 0,5 мл мясо-пептонным бульоном. Получают разведение пенициллина в 1-й пробирке - 2,5 ЕД/мл.Далее делают двукратные разведения антибиотика в 0,5 мл мясо-пептонного бульона. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры. В результате микробная нагрузка во всех пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры, при этом концентрация пенициллина в 1-й пробирке уменьшается еще в 2 раза и соответствует 1,25 ЕД/мл. Таким образом, получают разведения пенициллина: в 1-й пробирке - 1,25 ЕД          в 6-й пробирке - 0,035 ЕД во 2-й пробирке - 0,62 ЕД          в 7-й пробирке - 0,017 ЕД в 3-й пробирке - 0,31 ЕД          в 8-й пробирке - 0,008 ЕД в 4-й пробирке - 0,15 ЕД          в 9-й пробирке - 0,004 ЕД. в 5-й пробирке - 0,07 ЕДПоследняя 10-я пробирка не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности тест-культуры (табл.17).Таблица 17Концентрация стандарта бензилпенициллина

Время обесцвечивания метиленового синего, ч	Учет интенсивности клеточного дыхания									Контроль тест-культуры
	Разведение антибиотика в ед/мл
	1,25	0,62	0,31	0,15	0,07	0,035	0,015	0,007	0,0035	К
1	-	-	-	-	±	+	+	+	+	+
2	-	-	-	-	-	+	+	+	+	+

Обозначения: (+) - полное обесцвечивание метиленового синего,(+-) - частичное обесцвечивание метиленового синего, (-) - отсутствие обесцвечивания. Приготовление стандарта стрептомицина Во флакон, содержащий 500000 ЕД стрептомицина сульфата товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М фосфатного буфера, pH 6,0-6,2. Концентрация исходного раствора стрептомицина составляет 50000 ЕД/мл. Далее исходный раствор разводят в 10 раз 0,066 М фосфатным буфером, pH 7,8-8,0. Получают раствор 5000 ЕД/мл. Последующие разведения готовят на 0,066 М фосфатном буфере, pH 7,8-8,0, аналогично вышеописанной схеме к бензилпенициллину. Приготовление стандарта тетрациклина Для приготовления исходных растворов антибиотиков могут быть использованы лекарственные препараты антибиотиков или стандарты препаратов с известной активностью. В первичном растворе каждого антибиотика учитывают его активность в 1 мг (при использовании стандарта препарата) или содержание активного вещества в лекарственной форме (например, 100000 ЕД во флаконе). Основную концентрацию 1000 ЕД/мл или 1000 мкг/мл готовят, разводя препарат во флаконе, содержащем 100000 ЕД тетрациклина, в 100 раз.При активности стандарта тетрациклина 850 мкг/мл в 10 мг навескисодержится 8500 мкг антибиотика. Для получения первого разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливают необходимый объем растворителя:850х10=8500:1000=8,5 мл. Таким образом, навеску тетрациклина 10 мг растворяют в 8,5 мл 0,01 н. раствором HCI и получают концентрацию основного раствора 1000 мкг/мл. Приготовленный основной раствор может храниться в холодильнике в течение 7 дней. Далее основной раствор 1000 мкг/мл разводят десятикратно цитратно-солянокислым буфером, pH 6,0-6,2, до 100 и 10 мкг/мл. Все последующие разведения, готовят также на цитратно-солянокислом буфере, pH 6,0-6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина аналогично схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.6. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе Параллельно ставят второй ряд с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках с заранее разлитым мясо-пептонным бульоном в объеме 0,5 мл. Во все пробирки этого ряда также вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры (т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего через 1 ч инкубации в термостате).В результате микробная нагрузка уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры. Таким образом, 1-я пробирка каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1:4. Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре 37±1°C в течение 1 или 2 ч.Учет результатов производят по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культуры через 1 или 2 ч инкубации в термостате (табл. 18).Таблица 18Концентрация бензилпенициллина в испытуемом субстрате

Время обесцвечивания метиленового синего, ч	Учет интенсивности клеточного дыхания									Контроль тест-культуры
	Разведение испытуемого субстрата или образца
	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	К
1	-	±	+	+	+	+	+	+	+	+
2	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+

Концентрацию антибиотика в исследуемом субстрате с неизвестным его количеством вычисляют путем умножения последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект. Как видно из табл.16, последнее разведение стандарта бензилпенициллина вызывает полное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры, по сравнению с контролем, только через 2 ч инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/мл. Через 1 ч инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной активности клеток. Таким образом, концентрация пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует 0,07 ЕД/мл через 2 ч инкубации в термостате при температуре 37±1°C.Учесть результат в данном опыте возможно только через 2 ч инкубации по полному подавлению дегидрогеназной активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1:8, так как через 1 ч инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем (табл.18).Содержание пенициллина в исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата, подавляющее дегидрогеназную активность клеток тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект, т.е.0,07х8=0,56 ЕД/мл. Таким образом, в испытуемом субстрате содержится 0,56 ЕД/мл пенициллина.

Определение содержания афлатоксина М1 в молоке. Афлатоксины представляют собой токсины, продуцируемые микроскопическими грибами Aspergillus flavus и A. рarasiticus. В естественных условиях афлатоксины загрязняют арахис, кукурузу, некоторые зерновые, бобы какао и ряд других пищевых продуктов, а также корма сельскохозяйственных животных.

В естественных условиях встречаются 4 афлатоксина: афлатоксины В1 и В2и афлатоксины G1 и G2. Среди них высокими токсическими свойствами инаиболее широкой распространенностью выделяется афлатоксин В1.

С молоком коров, потреблявших корма, загрязненные афлатоксинами В1 и В2, может выделяться до 3% потребленных афлатоксинов в виде соответствующих гидрооксилированных метаболитов - афлатоксинов М1 и М2.

Биологическая активность афлатоксинов проявляется в виде как острого токсического эффекта, так и отдаленных последствий - канцерогенного, мутагенного и тератогенного эффектов. В настоящее время существуют убедительные эпидемиологические данные, указывающие на прямую корреляцию между частотой первичного рака печени и уровня содержания афлатоксинов в пищевых продуктах в ряде стран Юго-Восточной Азии.

Согласно Федерального закона РФ от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" в молоке-сырье регламентируется содержание афлатоксина М1 – не более 0,0005 мг/кг.

Одним из наиболее эффективных методов определения является метод определения афлатоксинов по изменению интенсивности их флуорсценции при высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Приборы и реактивы: аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ротационный испаритель с ловушкой, модель ИР-2 М,  жидкостный хроматограф высокой эффективности "Altex" модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа "Ultrasphere Si", с размером частиц 5 мкм; длина колонки 25 см, предколонки 4,5 см, внутренний диаметр колонок 0.46 см; флуоресцентный детектор "Kratos" модель FS-970 с кюветой заполненной силикагелем или другой детектор с аналогичными параметрами; воронки делительные ВД2-250 или ВД2-500; силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100-250 мкм; цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл; колонка стеклянная хроматографическая 2300х15 мм; афлатоксин М1;  ацетон; гексан; бензол; ацетонитрил; хлороформ медицинский; эфир диэтиловый медицинский; вода дистиллированная; кислота уксусная; сульфат натрия безводный; натрий хлористый.

Метод включает следующие стадии:

- экстракцию афлатоксинов из образца;

- очистку экстрактов от белков, липидов, пигментов;

- разделение, идентификацию и определение содержания афлатоксинов с помощью нормально фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным или ультрафиолетовым детекторами.

1. Экстракция.

В коническую колбу на 250 мл помещают 50 мл натурального молока или раствор 5г сухого молока в 50 мл воды, 10мл водного раствора 2г хлорида натрия и 0,24г лимонной кислоты, 120 мл хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры 35-38°С). Содержимое колбы встряхивают 2-3 минуты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при 3000-40000 об/мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, замеряют объем фильтрата (V2) и упаривают до 5 мл.

Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5мм), заливают суспензию 2 г (2 мл) силикагеля в гексане и сверху насыпают слой безводного сульфата натрия. Дают гексану стечь так, чтобы над слоем сульфата натрия осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта. Дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают 25 мл смесями толуол-уксусная кислота (9.5:0.5), 25 мл гексана и 25 мл смеси эфир-гексанацетонитрил (5:3:1). Афлатоксин М1 элюируют с колонки 60 мл смеси хлороформацетон (4:1). Элюат упаривают досуха, растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью ВЭЖХ.

2. Приготовление стандартного раствора афлатоксина М1.

Навеску кристаллического афлатоксина М1 в 1 мг помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация афлатоксина М1 в приготовленном стандартном растворе составляет 10 нг/мкл. Для приготовления стандартного раствора афлатоксина М1 с концентрацией 0.2 нг/мкл в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного раствора афлатоксина М1 и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1).

3. Обнаружение и количественное определение афлатоксина М1 с помощью ВЭЖХ.

Чувствительность детектора устанавливается таким образом, чтобы 0,6-0,8 нг афлатоксина М1 соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1, 2, 3 мкл рабочего раствора афлатоксина М1, что соответствует 0,2, 0,4, 0,6 нг афлатоксина М1. Для каждого количества афлатоксинов измеряют высоту пика. В приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина М1 8-9 минут.

В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени с афлатоксином М1, определяют его высоту (h). Расчет концентрации афлатоксина М1 проводят по формуле:

С=   V1 x V3 x h x mст

  V2 x V4 x hст. x M

Где С - концентрация афлатоксина М1 в молоке, мкг/кг;

V1 - объем хлороформа, взятого для экстракции (120 мл);

V2 - объем хлороформного экстракта, взятого для анализа;

V3 - объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ (200 мкл);

V4 - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора хроматографа (20 мкл);

mст.- количество нг афлатоксина М1 в введенном объеме стандарта;

hст. - высота пика стандарта афлатоксина в мм;

h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;

М - навеска продукта, взятая в г.

 

Если пик афлатоксина М1 в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого в инжектор раствора экстракта (V4) или разбавляя раствор экстракта хлороформом (увеличивая объем V3).

Определение пестицидов в молоке. Согласно Федерального закона РФ от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию", в молоке-сырье регламентируется содержание хлорорганических соединений – изомеров гексахлорциклогексана (ГХЦГ), а также ДДТ и его метаболитов.

 В настоящее время наиболее точными и эффективными методами определения остаточных количеств пестицидов в продуктах питания являются методы тонкослойной и газожидкостной хроматографии. Осуществляется определение по ГОСТ 23452-79 «Молоко и молочные продукты. Методы определения остаточных количеств хлорорганических пестицидов».

Принцип метода. Метод основан на хроматографии хлорсодержащих пестицидов в тонком слое окиси алюминия, силикагеля или пластинок "Силуфол" в различных системах подвижных растворителей после экстракции их из исследуемых образцов и очистке экстрактов. Подвижным растворителем служит н-гексан или н-гексан в смеси с ацетоном.

Приборы и реактивы: ацетон, аммиак водный, алюминия окись 2 ст. активности для хроматографии, бензол, Н-гексан, калий щавелевокислый, кальций сернокислый, кремния окись для люминофоров, натрий углекислый кислый, 0,5N раствор, натрий хлористый, насыщенный раствор, петролейный эфир (темп. кип. 40 - 70°), перекись водорода (30% водный раствор), серебро азотнокислое, серная кислота, силикагель КCK, стеклянная вата, очищенная конц. серной кислотой, промытая дистиллированной водой и высушенная, о-толидин,1%-ный paствор в ацетоне, 2-фенокспэтанол, этиловый спирт-ректификат, хлороформ, четыреххлористый углерод, этиловый эфир (для наркоза), натрий сернокислый, 2% водный раствор, натрий сернокислый, насыщенный раствор; баня водяная, вакуумно-ротационный испаритель, ИР ТУ 25-II-310-69 или прибор для отгонки растворителей, МРТУ 22-II-67-67, воронки химические, диам. 6 см, воронки делительные, емкостью 100, 250, 500 мл, воронки Бюмнера, гомогенизатор или измельчитель тканей, камера для опрыскивания, камера для хроматографирования, размером 150 х 200, 105 х 165 мм, колбы Бунзена, колбы мерные, емкостью 50, 100 мл, колбы нш, емкость 100, 250, 500 мл, колбы круглодонные нш, емкостью 150, 250, 500 мл,  микропипетки, (для нанесения стандартных растворов), пипетки или шприцы для нанесения проб, пипетки емкостью 1, 5, 10 мл, прибор для встряхивания, МРТУ 2451-64, Ппластинки стеклянные 9 х 12, 13 х 18 см, пульверизаторы стеклянные для опрыскивания пластинок, стеклянные хроматографические колонки, (диаметр-высота) 20 х 400, 15 х 150, ртутно-кварцевая лампа, цилиндры мерные емкостью 25, 50, 100, 250, 500 мл, чашки выпарительные N 3.

Стандартные образцы: ДДТ, изомеры ГХЦГ.

Стандартные растворы: 10 мг соответствующего пестицида растворяют в мерной колбе на 100 мл в н-гексане и доводят до метки этим растворителем. Стандартные растворы необходимо хранить в стеклянной посуде с притертыми пробками в холодильнике.

Проявляющие реактивы:

Проявляющий реактив N1. 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 7 мл аммиака и доводят объем раствора до 100 мл ацетоном: в готовый раствор можно добавить 0,2 мл перекиси водорода. Раствор следует хранить в колбе с притертой пробкой в темном месте в течение 3-х дней. На пластинку 9 х 12 см расходуется 8 - 10 мл раствора.

Проявляющий реактив N2., 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола и доводят объем раствора до 200 мл ацетоном, затем добавляют 6 капель 30%-ной перекиси водорода.

Приготовление пластинок для хроматографии. Тщательно промытую хромовой смесью, раствором соды, дистиллированной водой и высушенную пластинку протирают этиловым спиртом или эфиром и покрывают сорбционной массой. Массу готовят следующим образом:

а) 50 г просеянной через сито окиси алюминия смешивают в фарфоровой ступке с 5 г сернокислого кальция, прибавляют 75 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до образования однородной массы. На пластинку 9 х 12 см наносят 10 г сорбционной массы (на пластинку 13 х 18 см - 20 г) и, покачивая, равномерно распределяют по всей пластинке. Пластинки сушат при комнатной температуре 18 - 20 часов, можно сушить их 20 минут при комнатной температуре, а затем 45 минут в сушильном шкафу при температуре 110°С.

б) 35 г силикагеля КСК, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 2 г сернокислого кальция и 90 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до однородной массы. Наносят на пластинки и сушат как указано выше. Порция расчитана на 10 пластинок.

Если пластинки с тонким слоем силикагеля темнеют после облучения УФ-светом, силикагель перед употреблением следует очистить от примесей. Для этого силикагель заливают на 18 - 20 часов разбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят в круглодонной колбе 2 - 3 часа с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают проточной водопроводной, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 - 6 часов при температуре 130°. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш.

Подготовка хроматографических колонок для очистки экстрактов. Хроматографическая колонка для очистки от молочного жира. В нижнюю часть хроматографической колонки (размером 20 x 400 мм) помещают стекловату или 500 мг обезжиренной ваты. Затем засыпают в колонку силикагель АСК (75 мл для очистки экстрактов из проб свиного жира и 70 мл для всех остальных проб) и уплотняют силикагелъ постукиванием по колонке. Колонку промывают 50 мл н-гексана или петролейного эфира и прошедший через нее растворитель отбрасывают. После этого колонка готова для хроматографической очистки экстрактов из проб рыбы, мяса и мясопродуктов, молока и молокопродуктов, меда, яиц и т.д.

Проведение анализа

Для подготовки проб молока и молочных продуктов можно использовать один из приведенных способов.

Первый способ. Сливки, сметана, молоко и др. цельномолочные продукты. Для анализа берут 20 г сливок и сметаны, предварительно разведенных равным объемом дистиллированной воды, 50 мл молока, кефира и т.п. прибавляют концентрированную серную кислоту (30 - 40 мл) до полного почернения пробы. Охлажденный до 10-15°С раствор переносят в делительную воронку и экстрагируют препараты гексаном 2 раза порциями по 25 мл. Для полного извлечения воронку встряхивают 2 минуты, затем оставляют ее на 30 минут до полного разделения слоев. Если образуется эмульсия, прибавляют 1 - 2 мл этилового спирта. К объединенным экстрактам в делительной воронке прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты, насыщенной сернокислым натрием, и осторожно встряхивают несколько раз. Очистку продолжают до получения бесцветной серной кислоты.

Второй способ. Молоко, кефир, простокваша, кумыс и другие цельномолочные продукты. 25 мл продукта помещают в делительную воронку на 300 мл, приливают по 5 мл щавелевокислого калия и насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают, приливают 100 мл ацетона, встряхивают 2 минуты. Приливают 100 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронку оставляют до полного разделения слоев. Верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю выливают в круглодонную колбу со шлифом и испаряют растворитель досуха. Остаток смывают 30 мл гексана.

Хроматографирование. На хроматографическую пластинку на расстоянии 1,5 см от ее края шприцем или пипеткой наносят исследуемую пробу в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Остаток экстракта в колбочке смывают тремя порциями (по 0,2 мл) диэтилового эфира, которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие 10, 5, 1 мкг исследуемых препаратов (или другие количества близкие к определяемым концентрациям).

Пластинки с нанесенными растворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30 минут до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель. При использовании пластинок с тонким слоем окиси алюминия или силикагеля в качестве подвижного растворителя применяют н-гексан или смесь гексана с ацетоном в соотношении 6:1, для препаратов, у которых величина Rf в гексане ниже 0,3.

После того как фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают проявляющим реактивом и подвергают действию УФ света в течение 10 - 15 минут (лампа ПРК-4). Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света.

При наличии хлорорганических пестицидов на пластинке появляются пятна серо-черного цвета.

Количественное определение осуществляют сравнением площадей пятен пробы и стандартных растворов. Между количеством препарата в пробе, не превышающем 20 мкг, и площадью его пятна на пластинке существует прямая пропорциональная зависимость. При большем содержании препарата следует использовать пропорциональную часть исследуемого экстракта.

Количество препарата в пробе вычисляют по формуле:

Х = А S₁

                                P S₁

где X - содержание препарата в пробе, мг/кг или мг/л,

A - содержание препарата в стандартном растворе, мкг

S₁ - площадь пятна стандартного раствора, мм2

S₂ - площадь пятна пробы, мм2

Р - масса или объем исследуемой пробы, г или мл

Таблица 19

Величина R_f хлорорганических пестицидов

Пестицид	Подвижный растворитель	Величина Rf
		На окиси алюминия	На силикагеле
Гексахлорбензол	Гексан	0,9	-
2,4-ДДТ	Гексан	0,67	0,54
4,4-ДДТ	-«-	0,61	0,50
4,4-ДДТ	Гексан + ацетон (6:1)	0,75	-
ГХЦГ	Гексан	0,34	0,20