Основные принципы и этапы приготовления гистологических препаратов.

Изготовление гистологических препаратов складывается из следующих основных этапов:

1. Взятие и фиксация биологических объектов;
2. Промывка, обезвоживание и заливка биологических объектов;
3. Приготовление срезов;
4. Окрашивание и заключение срезов.

1 - взятие и фиксация биологических объектов. Главное требование: максимальное сокращение сроков взятия материала, минимальное травмирование тканей и создание оптимальных условий для фиксации. Для умерщвления лабораторных животных применяется наркоз, декапитация, электрический ток. (Перед этим нужно получить разрешение на убийство животного, для приготовления препаратов, у специальной комиссии) Затем следует быстрое вскрытие животного, извлечение необходимых органов и тканей, из которых острым инструментом вырезают небольшие кусочки (5-10 мм³) и помещают их в фиксатор. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого объекта в 20-40 раз. Фиксация предупреждает развитие посмертных изменений в тканях, прекращая в них биохимические процессы. Применяют различные фиксаторы: простые, содержащие один компонент (формалин, спирт, ацетон) и сложные, содержащие два и более компонентов (жидкость Карнуа: абсолютный спирт, хлороформ, ледяная уксусная кислота; жидкость Ценкера).

 

2 - промывание, обезвоживание и заливка биологических объектов. Для получения тонких срезов зафиксированные биологические объекты необходимо подготовить соответствующим образом: сделать его достаточно плотным, но не хрупким. После фиксации кусочки промывают под проточной водой в течение 12-24 часов для освобождения от излишков фиксатора. Для объектов, фиксированных в спирте или жидкости Карнуа, этот этап пропускают. После промывания объекты необходимо дегидрировать и уплотнить в спиртах возрастающей крепости. Далее кусочки обесцвечивают, для чего их помещают сначала в смесь абсолютного спирта (100^о) и О-ксилола (1:1), затем в две-три порции чистого О-ксилола. После просветления материал готов к пропитыванию в парафинах. Для этого объекты помещают в термостат сначала в кашицу (смесь равных частей О-ксилола и парафина) при температуре 37^оС, а затем в две-три порции чистого парафина, расплавленного при температуре 56^оС. Пропитанные парафином кусочки наклеивают на деревянные блоки. Подготовленные таким образом биологические объекты могут длительное время храниться на открытом воздухе.

Для обработки твердых тканей (кости, зубы) сразу же после фиксации и промывки материала используют методику декальцинации при помощи 5-7% раствора азотной кислоты. По мере вымывания солей кальция под действием кислоты, твердые ткани становятся мягкими, при этом их гистологическая структура сохраняется за счет оставшихся органических веществ. После декальцинации необходимо повторно промыть кусочки под проточной водой, затем обезводить, просветлить и залить в парафин. Так же используется метод, где из костной пластинки делают шлиф на наждачном камне, который окрашивают и фиксируют.

 

3 - приготовление гистологических срезов. Для приготовления срезов используют специальные приборы – микротомы. Их три типа: санный, ротационный и замораживающий. Санный микротом позволяет получать ступенчатые срезы, ротационный – серийные, замораживающий дает возможность получать срезы фиксированного и нефиксированного биологического материала без предварительной заливки в парафин.

Полученные парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином (1:1) и подсушивают на воздухе, либо в термостате при 37^оС. Срезы, приготовленные на замораживающем микротоме помещают в чашку с дистиллированной водой, после чего сразу же окрашивают.

 

4 - окрашивание и заключение срезов. Окрашивание срезов применяется для того, чтобы отчетливо видеть под микроскопом строение органа, и основано на неодинаковом химическом составе тканевых структур. Для окрашивания применяется большое количество красителей. Все их можно разделить по происхождению: растительные (гематоксилин), животные (кармин), синтетические (эозин и др.); а также по химическим свойствам: кислые, основные, нейтральные.

Способность структур окрашиваться основными красителями называется базофилией. В клетке базофильной структурой является ядро, содержащее нуклеиновые кислоты. К базофильным красителям относятся гематоксилин, кармин, тионин.

Структуры, окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными(ацидофильными), например, цитоплазма клеток. Кислыми красителями являются производные кислот или их соли (эозин, кислый фуксин).

Нейтральные красители (трипановая синь, нейтральный красный).

 

Существуют, кроме того, специфические красители. Например, эластические волокна окрашиваются орсеином в красно-коричневый цвет, резорцин-фуксином – в темно-синий, альдегид-фуксином – в темно-пурпурный. Жиры и жирорастворимые вещества в клетках окрашиваются суданом III в оранжевый цвет, осмий же окрашивает жиры в черный цвет. Для выявления элементов нервной системы применяется метод импрегнации азотнокислым серебром.

Перед любым окрашиванием со срезов удаляют парафин, этот процесс называется депарафинизация. Для этого срезы последовательно проводят через три порции О-ксилола, спирты нисходящей крепости (от 100^о до 70^о), затем помещают в дистиллированную воду. Замороженные срезы не требуют депарафинизации.

Наиболее часто применяется окраска гематоксилином и эозином. Для чего срезы помещают в раствор гематоксилина на 3-5 мин, затем в водопроводную воду – для промывания и дифференцировки. После приобретения ядрами клеток фиолетового цвета (контролируется под микроскопом), производят окрашивание в растворе эозина в течение 0,5-1,5 мин, промывают в дистиллированной воде и обезвоживают в спиртах восходящей крепости (от 70^о до 100^о). Далее, для удаления спирта и просветления срезов помещают последовательно в три порции О-ксилола и заключают в канадский бальзам(древесная смола).

В некоторых случаях препарат по условиям обработки не может соприкасаться со спиртами, О-ксилолом (например, при окраске на жир), что вызывает необходимость заключать в среды, смешивающиеся с водой: глицерин, глицерин-желатина и др.

 

Гистохимия.

 

При помощи цито- и гистохимических реакций удается не только выявить то или иное химическое соединение, но и установить локализацию вещества в клетках, проследить за изменением его в процессе жизнедеятельности, т.е. изучить обменные процессы. В настоящее время имеются гистохимические методики, позволяющие изучить основные этапы обмена белков, липидов, полисахаридов, активность ряда ферментов, основные неорганические компоненты клеток. К гистохимическим реакциям применимы некоторые основные требования:

1. сохранение строгой прижизненной локализации химического соединения;

2. специфичность и высокая чувствительность реакции;

3. химические реактивы не должны вступать в обменные процессы;

4. проведение контрольных реакций (удаление изучаемого вещества);

5. конечный продукт реакции должен быть окрашен.

Гистохимические реакции дают качественную оценку, в сочетании с цитофотометрическими исследованиями они позволяют определить количество исследуемого компонента.

 

Выявление полисахаридов.

Метод основан на окислении полисахаридов при помощи 0,5%-ного раствора йодной кислоты до высокомолекулярных альдегидных соединений, которые затем выявляются реактивом Шиффа. Полисахариды окрашиваются в яркий красно-фиолетовый цвет. Контроль с амилазой позволяет отдифференцировать от других полисахаридов. Реакция на полисахариды носит название ШИК-реакция (аббревиатура от Шифф-йодная кислота), а метод окраски назван по имени автора – Шабадаша-Мак Мануса-Хочкиса.