Методы молекулярной диагностики. Общие понятия.

Использование молекулярных методов привело к увеличению специфичности, чувствительности диагностики инфекционной и неинфекционной патологии. Применение молекулярных методов незаменимо в случае:

1) отрицательных результатов диагностики классическими методами;

2) использования для диагностики образцов, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни;

3) необходимости получения срочного диагностического результата;

4) диагностики инфекций, вызываемых некультивируемыми или «привередливыми» микроорганизмов. Молекулярно-генетические методы идентификации и типирования микроорганизмов основываются на:

Изучении различий нуклеиновых кислот

а) анализ плазмидного профиля. Используют для определения распространенности плазмид резистентности среди микроорганизмов в различных медицинских центрах.

б) макрорестрикционный анализ. Используют для выявления видовых и подвидовых различий микроорганизмов. Позволяет определять различия в рестрикционных профилях геномной ДНК микроорганизмов. Рестрикционные нуклеазы нарезают геномную ДНК на фрагменты размером 10 000- 800 000 п.о. Фрагменты разделяют гель-электрофорезом в пульсирующем поле (PFGE).

ДНК гибридизации

а) риботипирование. Используют для типирования микроорганизмов. Исследуемую ДНК нарезают рестриктазами на фрагменты, которые разделяются электрофорезом и переносят на мембрану. К фиксированным ДНК-фрагментам добавляют ДНК-зонды - 16S или (и) 23S рРНК опероны изучаемого вида микроорганизмов, меченые хемоколориметрической или хемилюминесцентной системой; в результате образуются легко выявляемые комплексы.

б) ДНК гибридизация. Используют для идентификации и типирования микроорганизмов. Меченые синтетические олигонуклеотидные зонды известной специфичности вступают в гибридизацию с изучаемой ДНК с образованием флюоресцирующих дуплексов.

В) гибридизационныебиочипы.

Полимеразной цепной реакциИ

8.Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основные понятия (принцип, температурные режимы, состав буфера)

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

1. Выделенную ДНК из исследуемого образца,

2. Буферный раствор,

3. Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

4. Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

6. Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов:

1. Денатурация (температура 94^оС) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

2. Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60^оС) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

3. Элонгация (температура обычно 72^оС) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

 

 

9.Цели и принцип проведения реакции ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).

Полиморфизма длины рестрикционных фрагментов – метод обнаружения мутаций, основанный на сопоставлении профилей полос после разрезания геномнойДНК специфичными эндонуклеазами рестрикции - рестриктазами.

Цель. Метод нашел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетонурии, ß-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов HLA-системы. Однако сложности в подборе праймеров и в выборе оптимального режима ПДРФ ограничивают широкое применение этого метода.

Принцип.

Получение рекомбинантных ДНК. Для получения таких молекул первоначально выделяют ДНК из 2 разных источников. Каждую из них в отдельности фрагментируют, используя одну и ту же рестриктазу, расщепляющую ДНК с образованием "липких" концов. После процедуры нагревания и медленного охлаждения наряду с исходными молекулами могут образовываться рекомбинантные молекулы, состоящие из фрагментов связанных между собой "липкими" концами.

Клонирование ДНК. Для получения значительных количеств интересующего нас материала проводят клонирование ДНК, предполагающее встраивание нужного нам фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (или вектор). Вектор обеспечивает проникновение этой рекомбинантной, ДНК в бактериальные клетки. В качестве векторов используют плазмиды, фаги, ретро- и аденовирусы. Особенно часто в качестве вектора служит плазмидная ДНК.