Глава 2. Тонкослойная хроматография.

Теоретические основы метода

Если сорбент помещён не в колонку, а в виде тонкого слоя на пластинке, то мы получим один из вариантов хроматографии – тонкослойную хроматографию (ТСX).

Метод ТСХ разработан советскими учеными Н.А. Измайловым и М.С. Брайбер ещё в 1938 г. По чувствительности и возможности определения веществ в сложных смесях и в малых количествах ТСХ превосходит все известные приёмы аналитической химии. Основное достоинство ТСХ заключается в несложности аппаратуры, простоте и большей скорости проведения эксперимента, достаточной чёткости разделения смеси веществ и в возможности анализа ультрамикроскопических количеств вещества.

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, как и в колонке, обусловлен переносом подвижной жидкой фазы вдоль слоя неподвижного твердого носителя и переносом компонентов разделяемой смеси по слою с различными скоростями. Однако в тонком слое вещества разделяемой смеси диффундируют не только в продольном направлении, как это имеет место в колонке, но и в поперечном. Кроме того, движение подвижной фазы в тонком слое обусловлено не гравитационными силами, как в колонке, а капиллярными, преобладающими над гравитационными. Процесс в тонком слое следует рассматривать как двумерный, при котором диффузионная массопередача в поперечном направлении соизмерима с продольной диффузией.

Для характеристики сорбционных свойств системы сорбат-сорбент в тонком слое вводят понятие подвижности R_f.

 

Рис. 3. Схема определения величины Rf при хроматографировании в тонком слое сорбента.

 

За R_f принимают отношение расстояния X_i, пройденное зоной вещества от стартовой линии до центра зоны, к расстоянию X_f, пройденному растворителем за то же время (X_f равно расстоянию от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта):

(3)

Понятно, что X_i не может быть больше X_f. Поэтому значения R_f лежат в пределах от нуля до единицы.

Если значения X для различных веществ неодинаковы, то и значения R_f также будут различны. Следовательно, R_f может служить сорбционной характеристикой системы сорбат-сорбент и в данных условиях опыта, для данных веществ, сорбента и растворителя есть величина постоянная.

При малых значениях R_f и уменьшении продолжительности анализа достигается минимальное размывание зоны вещества на сорбенте. Следовательно, в этих условиях концентрация вещества максимальна, что приводит к увеличению чувствительности анализа.

Определяя оптимальный размер диаметра зёрен сорбента, необходимо учитывать следующие обстоятельства. При уменьшении диаметра зёрен уменьшается сопротивление массопередаче. Поэтому влияние на размывание кинетических факторов становится менее значительным. Однако при этом уменьшается скорость движения растворителя, так как увеличивается гидродинамическое сопротивление слоя. Следовательно, уменьшение диаметра зерна приводит к увеличению времени анализа, а это вызывает усиление диффузионного размывания. Оптимальным можно считать такой размер зерен сорбента, при котором суммарное влияние размывающих факторов было бы минимальным.

Таким образом, теоретические представления о процессе в тонком слое и выведенные на их основе закономерности позволяют рассчитать оптимальные условия опыта.

 

Методические варианты ТСХ

Хроматографирование в тонком слое может быть осуществлено в нескольких вариантах. Во-первых, слой сорбента может быть незакрепленным на пластинке и закрепленным.

В первом случае сорбент наносят на пластинку в виде порошка, покрывающего её равномерным тонким слоем. Пластинку для хроматографирования устанавливают в специальную камеру горизонтально или под углом к горизонтальной плоскости не более 15-20°.

Во втором случае сорбент предварительно смешивают с каким-либо связующим материалом и наносят на пластинку в виде пасты, распределяемой по поверхности пластинки ровным тонким слоем. В качестве связующих материалов обычно применяют медицинский гипс, очищенный крахмал и т.д. Пластинка с закрепленным слоем может устанавливаться в камере в любом положении вплоть до вертикального. Некоторые фирмы выпускают пластинки с закрепленным слоем, изготовленные машинным способом и в готовом для эксперимента виде.

В качестве пластин, служащих подложкой для сорбента, чаще всего применяют стекло, алюминиевую фольгу или полиэфирную плёнку. Стеклянные пластинки наиболее универсальны вследствие устойчивости к воздействию любых растворителей и реагентов, применяющихся в ТСХ. Алюминиевые и пластмассовые пластинки эластичны, поэтому им можно придавать любую форму. Кроме того, полиэфирные плёнки прозрачны для УФ излучения в пределах до 320 нм и, следовательно, на них можно производить фотометрирование пятен непосредственно в слое. Некоторые фирмы изготовляют пластинки со слоем, разделенным небольшими промежутками на отдельные дорожки, что позволяет предотвратить возможное перекрывание соседних пятен при хроматографировании.

Наконец, выпускаются стеклянные пластинки, покрытые тонким слоем силикагеля и прочно связанные с ним химическими связями. Последнее достигается обжигом силикагеля, нанесённого на стекло. Такие пластинки возможно использовать многократно, не удаляя слоя сорбента, а лишь регенерируя его растворителями или же хромовой кислотой с последующей промывкой водой и сушкой при 120 °С.

Движение растворителя вдоль слоя также может происходить по-разному. В восходящей хроматографии растворитель поднимается снизу вверх, причём его движение обусловлено лишь действием капиллярных сил. Компоненты смеси остаются на слое в виде пятен.

В нисходящей хроматографии растворитель продвигается по слою сверху вниз под действием как капиллярных, так и гравитационных сил. Если процесс останавливается при достижении фронтом растворителя нижней границы слоя сорбента, то компоненты разделяемой смеси остаются в слое в виде пятен. Если же хроматографический процесс продолжать, то растворитель стекает со слоя и вымывает компоненты анализируемой смеси. В этом случае, как в колоночной хроматографии, раствор собирают отдельными порциями и анализируют. Однако широкого распространения в таком виде нисходящая хроматография не получила.

Горизонтальная хроматография может выполняться в двух вариантах: в виде круговой и со свободным испарением растворителя.

В круговой хроматографии пластинку устанавливают строго горизонтально. Пробу исследуемой смеси наносят в виде капли в центре пластинки. Туда же непрерывно подают растворитель, который под действием капиллярных сил движется по слою в радиальном направлении от центра. Компоненты анализируемой смеси располагаются в слое согласно их сорбционным свойствам в виде концентрических колец. Метод чрезвычайно быстр, поэтому он применяется в предварительных испытаниях при подборе сорбента или растворителя для анализа неизвестной смеси.

Во втором варианте горизонтальной хроматографии пластинку устанавливают в камере строго горизонтально, а растворитель подают с одного края пластинки по всей её ширине. После прохождения растворителем некоторого расстояния пластинку вынимают из герметической камеры и помещают в открытую камеру. При этом растворитель частично испаряется. Этот метод применяют, если необходимо разделить смесь веществ с близкими значениями R_f.

Двумерную хроматографию применяют, если разделение смеси при помощи однократного хроматографирования не достигается. В этом случае после первого хроматографирования пластинку вынимают из камеры, испаряют растворитель, пластинку поворачивают на 90° и производят повторное хроматографирование в том же или ином растворителе в направлении, перпендикулярном первоначальному. При этом достигается значительно лучшее разделение.

В процессе хроматографирования можно изменять состав растворителя, сорбента или условия опыта. Если эти изменения происходят ступенчато, хроматография называется ступенчатой. Если изменения происходят непрерывно, хроматография называется градиентной.

Рекомендуется проводить хроматографирование сначала с растворителями, обеспечивающими разделение смеси неполярных соединений. После продвижения фронта растворителя до конца слоя пластинку вынимают из камеры и испаряют растворитель. Затем проводят хроматографирование с другим, более полярным растворителем, причём фронт этого растворителя должен пройти меньшее расстояние. При необходимости применяют третий растворитель, проводят хроматографирование в том же или обратном направлении, поворачивая пластинку на 180°.

Весьма перспективно применение градиентной хроматогра-фии. Метод может заключаться в постепенном изменении состава растворителя, концентрации его составляющих, полярности, значения pH или же в изменении состава сорбента его активности, структуры неподвижной жидкой фазы, а также вследствие введения в сорбент импрегнирующего вещества. Возможно градиентное изменение среды, например, температуры опыта, летучести растворителя, толщины слоя сорбента. Наконец, можно создавать чередующиеся слои сорбентов, нанося их на пластинку в виде полос, плотно прилегающих друг к другу.

В любом из вариантов градиентной хроматографии достигается лучшее разделение многокомпонентных смесей, чем при хроматографировании одним компонентом. Возможно разделение смеси очень близких по свойствам и структуре соединений. Понятно, что градиентная хроматография требует более сложной аппаратуры и большей продолжительности анализа.

Рассмотренные методы применяются для анализа смесей веществ и требуют, как правило, весьма малых количеств анализируемой пробы, измеряемых милли- и даже микрограммами. Однако при помощи ТСХ возможно выделение из смесей чистых веществ в граммовых количествах. Для этой цели служит препаративная ТСХ, обладающая рядом особенностей. Для препаративного выделения веществ обычно пользуются несколькими способами.

1 - Хроматографирование проводят в режиме аналитического разделения. На стартовую линию пластинки наносят несколько проб одной и той же смеси, или же пробу наносят сплошной полосой по всей стартовой линии. В последнем случае на хроматограмме получают не пятна, а полосы, которые и удаляют. Размеры пластинок увеличивают до 40x100 см. После проявления и фиксации пятна удаляют с пластинки, собирая вместе сорбент, содержащий одно и то же вещество. Затем производят экстракцию вещества с сорбента.

2 - Хроматографирование проводят методом нисходящей хроматографии и вымывают вещества с пластинки растворителем. Пробу наносят в виде полосы по стартовой линии. Собирают вместе фракции, содержащие одно и то же вещество, затем растворитель отгоняют.

3 - Приготовляют пластинки специально для препаративных целей, т.е. размером не менее 20x50 см и покрывают слоем сорбента толщиной до 1,5-3 мм. Это обстоятельство позволяет увеличить пробы, подлежащие разделению, до 20-25 мг вещества на 1 см длины стартовой линии. Хроматографирование по данному способу проводят методами восходящей или нисходящей хрома-тографии.

По сравнению с колоночной препаративной хроматографией ТСХ выгодно отличается значительной скоростью процесса и небольшими объёмами растворителя, но уступает в количестве выделяемого вещества.

При любом способе препаративного разделения следует обращать особое внимание на чистоту выбранных сорбентов и растворителей.

 

Сорбенты

Одним из решающих факторов, определяющих успешное решение разделения смеси веществ методом ТСХ является правильный выбор сорбента.

В адсорбционном варианте ТСХ обычно применяют силикагели, оксид алюминия, целлюлозу и некоторые другие адсорбенты с высокой адсорбционной способностью и низкой ионообменной ёмкостью. Наряду с силикагелем и оксидом алюминия в ТСХ применяют тонкодисперсные порошки целлюлозы. Они способны образовывать прочный слой на пластинке без добавки связующих материалов. Некоторые фирмы выпускают готовые пластинки с целлюлозой различных марок.

Хорошие результаты по разделению в тонком слое смесей как гидрофильных, так и лиофильных веществ достигаются на полиамидных сорбентах. Они являются органическими полимерами, обладающими концевыми аминными группами, обусловливающими адсорбцию нитрилов, нитросоединений и альдегидов. Наличие концевых карбоксильных групп обусловливает катионообменную способность полиамидов, а аминогрупп - анионообменную. Для локализации этих центров полиамиды ацетилируют.

Жидкими ионитами называют высокомолекулярные органические нерастворимые в воде полиэлектролиты. Для анализа в тонком слое ими пропитывают носители, такие как целлюлозу, фторопласт и др., предварительно нанесённые на пластинку в виде тонкого слоя. Жидкие иониты более селективны, чем смолы, они позволяют осуществлять ионный обмен с большей скоростью, чем смолы и не нарушают однородности слоя. В качестве примера жидкого ионита можно привести триоктилметил аммония.

Для ионного обмена в тонких слоях применяют специальные сорта ионообменной целлюлозы. В зависимости от природы активных групп ионообменные целлюлозы могут быть катионитами и анионитами. В тонких слоях этих целлюлоз можно разделять не только неорганические ионы, но и ряд органических соединений: пептидов, белков, нуклеотидов, липидов и т.д.

В последнее время стали применять минерально-органические иониты. Так называются сорбенты, в основе которых лежит какой-либо неорганический сорбент, например, силикагель, к которому путем радиационно-химического синтеза привит полимер, обладающий активной функциональной группой. Так, к силикагелю КСК посредством парофазной радиационно-хими-ческой реакции привит полимер стирола. Затем этот комплекс подвергнут сульфированию. В результате получился катионит с характерными для сильнокислотных ионитов свойствами. Такого рода привитые сорбенты существенно отличаются от ионитов как минерального, так и органического происхождения. Они выгодно сочетают в себе лучшие свойства как тех, так и других, обладая развитой удельной поверхностью, повышенной термической стойкостью, малой набухаемостью и высокой обменной ёмкостью.

В ТСХ используются и иониты на основе сефадексов - сшитых декстранов. Они одновременно сохраняют свойства молекулярных сит.

В тонком слое применяют также метод гель-проникающей хроматографии. В этом случае на пластинку наносят слой се- фадекса, не.имеющего ионных групп. Разделяющая способность таких сефадексов определяется степенью сшитости молекул полисахаридной цепочки, а также размерами молекул анализируемых веществ.

 

Растворители

Выбор растворителя также имеет значение для правильного решения задачи разделения и анализа смеси веществ. Он зависит, прежде всего, от природы сорбента, на котором происходит разделение смеси, а также от свойств анализируемых соединений.

Для разделения смесей органических соединений в качестве растворителей применяют не индивидуальные вещества, а смеси, состоящие из двух или трёх, реже четырёх жидкостей.

Для успешного разделения смеси и получения чётко выраженных пятен на пластинке большое значение имеет установление правильного соотношения смешиваемых веществ при составлении многокомпонентных растворителей.

При работе с многокомпонентными растворителями следует иметь в виду, что при движении фронта растворителя вдоль слоя сорбента происходит хроматографическое разделение и компонентов, образующих этот растворитель, как это имеет место при фронтальном анализе.

Наиболее слабо сорбирующийся компонент растворителя движется по слою быстрее, чем компонент, сорбирующийся сильнее. В результате фронт растворителя разделяется на несколько фронтов, а скорости движения зон анализируемых соединений отличаются от скоростей, с которыми фронт двигался бы, если бы отсутствовало разделение растворителя.

Ниже в таблице 1 перечислены некоторые растворители, применяющиеся в адсорбционной ТСХ.

Таблица 1