Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Неспецифические системы детекции
К неспецифическим системам детекции относятся системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с использованием меченных праймеров с адаптерной последовательностью (амплифлюры). 1.3.1.1.1 Интеркалирующие красители Использование интеркалирующих красителей (интеркаляторов) представляет собой наиболее дешевый и простой вариант окраски ДНК для проведения ПЦР в реальном времени. Интеркалирующие красители - это соединения, приобретающие способность флуоресцировать при встраивании в двухцепочечную ДНК. В настоящее время существует множество коммерчески доступных интеркаляторов: бромистый этидий, YOYO, SYBR Green. наиболее часто встречающийся в молекулярно-биологической лаборатории интеркалятор - бромистый этидий, применяемый для окрашивания ДНК при электрофорезе. Однако он плохо подходит для регистрации накопления ДНК в ходе реакции, поскольку негативно влияет на эффективность ПЦР. Наиболее распространенным вариантом красителя для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I. Несмотря на удобство в работе, метод использования интеркаляторов обладает существенным недостатком, поскольку интеркалирующие красители "проявляют" накопление любой ДНК, включая димеры праймеров. Поэтому образование флуоресцентного сигнала в ходе реакции не позволяет исследователю быть уверенным, что в результате амплификации наработан целевой фрагмент. Специфичность полученного продукта реакции в данном случае можно попытаться оценить с помощью анализа кривых плавления. Для этого, после окончания ПЦР пробирку медленно нагревают от 40°С до 95°С (или наоборот охлаждают от 95°С до 40°С) и одновременно регистрируют изменение флуоресценции (Рис. 9). Рис. 9 Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан график первой производной. Значения максимумов первых производных принимаются за температуру плавления ампликонов. Фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться (гибридизоваться) при разной температуре, что позволяет приблизительно оценить состав реакционной смеси после ПЦР. Данный подход имеет низкую разрешающую способность и обычно используется для различения димеров праймеров и длинных продуктов ПЦР. 1.3.1.1.2 Меченные праймеры с адаптерной последовательностью (амплифлюры)
Существует несколько вариантов использования адаптерных 5ʹ-концевых последовательностей для регистрации накопления продукта ПЦР с участием флуоресцентно меченного праймера. В наиболее простом варианте, праймер несёт дополнительную последовательность на 5ʹ-конце, способную образовывать шпилечную структуру (Рис. 10). Рис. 10 Схема работы праймеров "амплифлюр" а - праймер содержит 5ʹ-адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. При температуре элонгации, инвертированный повтор образует шпилечную структуру в которой флуорофор и гаситель оказываются сближены. В ходе синтеза второй цеп ДНК, шпилечная структура "разворачивается" и интенсивность флуоресценции возрастает. б - праймер содержит меченный 5ʹ-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи "сталкивает" олигонуклеотид с гасителем. Праймеры несут флуоресцентную метку (флуорофор) и гаситель флуоресценции, расположенные так, что при образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются пространственно сближенными. В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки, имеющую низкий уровень флуоресценции. В ходе реакции, шпилька меченного праймера раскрывается (поскольку меченный праймер становится частью двухцепочечного продукта), что приводит к усилению флуоресценции. Существует также вариант этого метода, при котором гаситель флуоресценции находится на отдельном нуклеотиде, комплементарном 5ʹ-концевой адаптерной последовательности. В этом случае, при встраивании праймера в ДНК гибридизация с гасящим олигонуклеотидом оказывается невозможной.
|
|||||
Последнее изменение этой страницы: 2020-10-24; просмотров: 405; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.227.161.132 (0.006 с.) |