Метод обратимых терминирующих нуклеотидов (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по отщепляемой метке)

Данная концепция была предложена Баласубрамяном и Кленерманом на химическом факультете Кембриджского университета. Также как и при пиросеквенировании, принцип метода состоит в регистрации факта присоединения очередного нуклеотида, но не по побочным продуктам реакции, а непосредственно по сигналу от присоединенного основания. При этом должны выполняться два требования:

1) за один цикл реакции может быть добавлен только один нуклеотид. Это легко обеспечить с использованием 3ʹ-блокированных dNTP с возможностью снятия блока.

2) метка должна быть отщепляемой.

Сначала любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например, методом мостиковой или эмульсионной ПЦР). Секвенирование начинают с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к библиотеке добавляют четыре типа флуоресцентно меченых обратимых терминирующих dNTP (так называемых RT-оснований). ДНК-полимераза присоединяет подходящий нуклеотид к затравке и на этом синтез временно останавливается.

Рис. 27 Принцип секвенирования синтезом клональной библиотеки одноцепочечных фрагментов ДНК на твердой фазе

Невключившиеся нуклеотиды смывают, и оптическая система считывает флуоресценцию каждой ДНК-колонии библиотеки. Каждая колония высвечивает при этом кванты флуоресценции, соответствующие включившемуся на данном этапе нуклеотиду. После этого флуорофор, наряду с 3ʹ-концевым блокатором, химически удаляют из синтезированной цепи, что позволяет повторить весь цикл сначала (Рис. 27).

В отличие от пиросеквенирования в данном подходе сигнал флуоресценции можно регистрировать в течение длительного времени после присоединения очередного нуклеотида, что позволяет производить анализ очень большого количества ДНК-колоний.

На данном принципе секвенирования основаны коммерческие технологии компаний Illumina и Pacific Bioscience.

2.8 Полупроводниковое секвенирование (регистрация акта присоединения нуклеотида по образующимся ионам водорода)

Полупроводниковое секвенирование - это метод определения последовательности ДНК, основанный на детекции ионов водорода, выделяющихся в среду в ходе ферментативного синтеза ДНК. Вначале, одним из стандартных методов создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК. Важно, чтобы метод создания библиотеки позволял отделить каждую колонию ДНК от других так, чтобы выравнивание рН в случае его изменения в районе колонии происходило не слишком быстро. При использовании эмульсионной ПЦР это обеспечивается закатыванием микросфер в соответствующие им по размерам микрореакторы так, что в реактор помещается только одна частица, а сообщаются реакторы только одной поверхностью на проточном чипе. Секвенирование начинают с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к микрореаторам, содержащим микросферы, по очереди добавляют обычные dNTP. Если добавленный нуклеотид оказывается комплементарным матрице, ДНК-полимераза встраивает его в синтезируемую цепь. Реакция образования фосфодиэфирной связи приводит к выделению пирофосфата и протона, вызывающего локальное изменение рН раствора в микрореакторе, которое детектируется подключенным к каждому микрореактору сенсором. Если нуклеотид не подходит, сигнал отсутствует. После каждого добавленного в реакцию нуклеотида, прибор выполняет промывку системы буфером для очистки от остатков невключившихся dNTP данного типа (Рис. 28).

Рис. 28 Полупроводниковое секвенирование

Как и в случае пиросеквенирования, у полопроводникового секвенирования есть трудности с детекцией гомополимерных участков. В случае протяженного мононуклеотида, например ТТТТТТТТ, сигнал теряет дискретность и определить, сколько именно нуклеотидов присутствует в последовательности становится затруднительно.

Важным отличием полупроводникового секвенирования от других методов является отсутствие оптического детектора сигнала, что значительно упрощает и удешевляет конструкцию прибора. Кроме того, отсутствие необходимости оптической детекции снимает ограничение по количеству микроцентров секвенирования, которые можно разместить на чипе.

На принципе полупроводникового секвенирования основана коммерческая технология IonTorrent, предоставляемая компанией Life Technologies Thermo Fisher Scientific. Разработки в данном направлении ведутся также компанией Roche.

Нанопоровое секвенирование

Еще одна оригинальная идея секвенирования была предложена Касьяновичем в 1996 г. Принцип метода заключается в регистрации изменений ионного тока, вызванного прохождением одноцепочечной ДНК через нанопору в тонкой пленке под действием электрического поля (Рис. 29).

Рис. 29 Принцип нанопорового секвенирования.

Проходящая через пору молекула одноцепочечной ДНК или РНК меняет потенциал на мембране.

Поры могут быть естественного биологического происхождения. Например, можно использовать биологическую мембрану с какой-либо порой. Также могут использоваться искусственные поры. Например, поры в виде сенсора для фиксации изменения какой-либо характеристики: туннельного тока, емкости, ионного тока или флуоресценции. При переходе через пору, каждый тип азотистых оснований по-своему "закупоривает" пору и влияет на ток.

В настоящее время данная технология реализована компанией Oxford Nanopore (Великобритания) в устройствах MinION, GridION и PromethION (Рис. 30).

Рис. 30 Приборы для нанопорового секвенирования: секвенаторы MinION (А), GridION (Б) и PromethION

В настоящее время, технологии Nanopore позволяют осуществлять:

- Прямое прочтение нуклеотидных последовательностей цепей ДНК и РНК

- Длина прочтения ограничена только длиной фрагмента.

- Наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает возможность остановки процесса в любой момент при достаточном накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других сбоях в работе; интерпретацию сигналов (base calling) и анализ данных можно проводить непосредственно в процессе секвенирования. Технология обеспечивает простой алгоритм сборки, полученных буквенных последовательностей.

В секвенаторе MinION используется ячейка с 512 нанопоровыми каналами, каждый из которых предназначен для анализа отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. В сумме прибор позволяет получить до 20 Гб информации о последовательности ДНК. Длина прочтения, ограничена только длиной фрагмента нуклеиновой кислоты и составляет сотни тысяч нуклеотидов. GridION, в отличие от MinION, состоит из пяти проточных ячеек с нанопоровыми каналами, что позволяет проводить пять параллельных независимых экспериментов. Общий объём информации о последовательности ДНК, полученный с помощью секвенатора GridION, может быть до 100 Гб. Методика характеризуется простой пробоподготовкой и возможностью анализировать последовательности любой длины. Секвенатор PromethION пердназначен для высокопроизводительного секвенирования. Прибор включает 24 независимые ячейки, каждая из которых содержит 3000 каналов. При анализе можно задействовать любое количество этих ячеек, в каждой из которых будет проводиться отдельный эксперимент. Анализ результатов происходит с помощью встроенного процессора.