Использование культуры клеток.

Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).

Этапы получения первичной культуры.

 

1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).

2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.

3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.

4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.

5. Проводят дробную трипсинизацию.

6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.

7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.

8. Клетки помещают в питательную среду:

- среда 199

- среда Игла

- среда гидролизатлактальбумина.

9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева

10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.

11. Добавляют 10% сыворотки КРС.

12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.

13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.

 

Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)

 

Используемые растворы.

1. раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)

2. раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.

3. Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.

4. Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.

 

Используемые среды.

1. Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.

2. Среда Игла (Eagle)

3. Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.

 

Заражение культуры клеток.

 

1. С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.

2. Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.

3. Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.

4. Помещают в термостат (30-60 минут)

5. Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.

6. Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.

 

Методу обнаружения вируса в культуре клеток.

 

ЦПД – цитопатическое действие.

1. Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.

2. Гибель клетки с фрагментацией.

3. Образование симпластов.

 

 

Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.

 

При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.

 

«РДП. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА МЕОДА, ПОСТАНОВКА И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ».

РДП в геле основана на способности к диффузии в гелях АТ и растворимых АГ и отсутствие такой способности у комплекса «АГ+АТ». Этот комплекс образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных АГ и АТ. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации. В качестве геля используют крахмал, желатин, агар-агар и другое. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель. АТ сыворотки представляют собой молекулы Ig, которые, несмотря на довольно крупные размеры. Способны диффундировать в агаровом геле. АГ вирусов – это вирусные белки. Они могут находится в составе вирионов, представляя так называемые корпускулярные АГ. Крупные размеры которые не позволяют им диффундировать в агаровом геле. Но белки вирусов могут быть и в виде свободных молекул, образующихся в результате деструкции вирионов и (или) разрушения клеток, в которых они образовались. Это растворимые АГ. Они способны к диффузии в агаровом геле. Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублении и в них наливают АГ и сыворотки так. Чтобы АГ и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок АГ и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими АГ и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс «АГ+АТ», который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает на месте образования в виде беловатой полосы преципитации. РДП решает задачи: 1) обнаружение в сыворотке крови АТ, гомологичных АГ; 2) обнаружение в материале АГ, гомологичного известным АТ сыворотки;3) идентификация неизвестного вируса; 4) титрование АТ сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным АГ, служит показателем титра АТ в сыворотке. РДП часто используют для диагностики лейкоза КРС и инфекционной анемии лошадей. Реакция м\б поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах, капиллярах (редко). Для осуществления РДП на предметных стеклах нужны: обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки (2-5 мл), пастеровские пипетки; трубка диаметром 5мм или штамп, влажная камера, инструмент для извлечения из лунок геля, агар, АГ, сыворотки. Постановка РДП: Предметные стекла кладут на холодную поверхность. Из пипетки наливают агар (слой 1,5-2 мм), дают остыть 5-10 минут. Вырезают лунки, запаивают их. В лунки заливают компоненты РДП, помещают во влажную камеру (где оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат). Препарат РДП на предметных стеклах можно через 48-72 часа высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранить препарат неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации. Плюсы РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми АГ, возможность документирования результата путем фотографирования. Минусы РДП: низкая чувствительность. Реакцию ставят для обнаружения в патматериале вирусов бешенства, инфекционного ринотрахеита КРС, африканской чумы свиней, чумы собак, других; А также для идентификации вирусов инфекционной анемии лошадей, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, вируса диареи КРС, для обнаружения в сыворотках крови АТ к вирусам инфекционной анемии лошадей, респираторно-синцитиального вируса КРС и во многих других случаях.