Основные принципы, лежащие в основе сепарации клеток, и их характеристики

 

Принцип	Метод	Характеристика
1. Различия клеток по плотности и плавучести	1.Метод седиментации	При добавлении к пробе крови избытка 3% ЭДТА или раствора желатина происходит ускоренное оседание RBC и обогащение плазмы крови лейкоцитами – образуется лейковзвесь (концентрат лейкоцитов в плазме)/
2. Центрифугирование на градиенте плотности	При центрифугировании крови на градиенте плотности происходит разделение популяций клеток по их плавучести/
2. Различия биологических характеристик клеток	3. Адгезия на пластике	Разные популяции клеток обладают разной степенью адгезивности, что позволят сепарировать, например, моноциты при инкубации клеточной суспензии на пластике/
4. Осмотический лизис эритроцитов	Позволяет удалить из порции крови или клеточной суспензии RBC путем кратковременного создания гипотоничной среды (путем добавления дистил­лированной воды или 0,83 % раствора NH4Cl). Ядросодержащие клетки способны выдержать это воздействие, тогда как RBC лизируются в течение нескольких секунд.
5. Фагоцитоз карбонильного железа с последующим магнитным удалением клеток	Позволяет удалить из суспензии клеток фагоциты (нейтрофилы и моноциты) путем предоставления им частиц карбонильного железа для фагоцитоза. Затем к стенке колбы с клеточной суспензией придвигают магнит, способствующий притяжению к этому месту фагоцитов. Другие клетки, находящиеся в суспензии отбираются из колбы пипеткой.
3. Наличие мембранных рецепторов	6. Розеткообразование	Позволяет провести с помощью моноклональных антител (МАТ) высокоспецифическое выделение клеток, экспрессирующих конкретный мембранный маркер.
7. Иммуносорбция
8.Лазерная проточная сортировка = FACS (fluorescence- activated cell sorting)
9.Магнитная клеточая сортировка = MACS (magnetic cell sorting)

Выделение лейкоцитов в градиенте плотности

 

Градиент плотности – это раствор определенного вещества, имеющего при разной концентрации разную плотность, которая может быть измерена специальным прибором - ареометром, и способные обеспечить оптимальные для клеток условия осмотичности среды.

Градиенты плотности широко применяются в разных областях медико-биологических наук. Так, в биохимии для выделения митохондрий и др. субклеточных органелл применяют градиент из раствора сахарозы, в вирусологии – из растворов солей кремния или цезия. В иммунологии наиболее широко применяют растительный полисахарид – фиколл, дополняемый рентгенокотрастным препаратом верографином (визотрастом и проч.), а также растворы перколла (частицы кремния диаметром 15-30 нм, покрытые поливинил-пирролидоном). Многие фирмы выпускают готовые градиенты плотности с заданными свойствами, либо их можно приготовить из отдельных ингредиентов. При этом рассчитывают необходимое количество порошка градиента, растворяют его в дистиллированной воде, проверяют плотность и при необходимости стерилизуют.

Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности (таблица 1.4) позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бластные клетки) от эритроцитов и гранулоцитов.

Таблица 1.4

Используемые градиенты плотности при выделении клеток человека (Cell separation methods and applications, edited by D.Recktenwald, 1997)

Тип клеток	Плотность градиента, г/см^3
Т-лимфоциты	1,077
В-лимфоциты	1,077
Моноциты	1,064
Гранулоциты	1,093
NK-лимфоциты	1,06
Эритроциты	1,115
Остеобласты	1,055

 

В результате центрифугирования суспензии клеток на градиенте плотности, происходит разделение клеток на фракции, схематично представленное на рисунке 1.4.

 

 

 

Рисунок 1.4 Седиментация клеток периферической крови при центрифугировании на градиенте плотности

 

Градиенты бывают одноступенчатые, как приведенный выше пример, когда используется градиент с одной плотностью, и двух- или трехступенчатый. В последнем случае используют 2 – 3 градиента с различной плотностью, причем на дно пробирки наливают градиент с более высокой плотностью, а на него – градиент с меньшей плотностью. Центрифугирование на 2 – 3-х ступенчатом градиенте позволяет выделить большее количество популяций лейкоцитов, однако, технически такой способ более сложный.