Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

 

Настоящий лабораторный практикум «методы иммунологических исследований» является составной частью дисциплины специализации «Методы иммунологических исследований. Иммунодефициты», преподаваемой студентам факультета экологической медицины в рамках специальности «медицинская экология».

Как известно, иммунология в процессе своего развития формировалась как наука экспериментальная. Поэтому разделы иммунологии, посвящённые методам исследований, представляются чрезвычайно важными для формирования молодых специалистов, предполагающих связать свою дальнейшую карьеру с этой наукой. Представленный в лабораторном практикуме методический материал охватывает значительный спектр методов и способов оценки параметров иммунной системы, наиболее распространённых и адаптированных для исследований иммунного статуса человека, т.е. применимый в рамках клинической иммунологии.

Лабораторный практикум «методы иммунологических исследований» содержит методический материал для проведения 8 лабораторных и 1 практического занятия. Включает лабораторные протоколы, схемы проведения исследований, список рекомендуемой для подготовки литературы. Значительное место уделено нормативной документации, касающейся вопросов организации иммунологических исследований, а также вопросам техники безопасности, оснащению лабораторий и алгоритмам закупки реактивов для исследования.

Методический материал практикума содержит информацию, имеющую самостоятельное значение и не дублируемую в лекционном материале. Каждая лабораторная работа предваряется целью, а также перечислением необходимого оборудования или принадлежностей. При подготовке к лабораторному занятию следует ознакомиться с теоретической частью соответствующей лабораторной работы, вернуться к материалу теоретического курса, что необходимо для работы по контрольным вопросам. При выполнении лабораторной работы необходимо следовать порядку протокола осваиваемой реакции или метода, фиксируя необходимую информацию в рабочей тетради. В конце лабораторного занятия делаются заключения по работе и разбираются возможные ошибки.

Список использованных сокращений

 

CD	Кластеры дифференцировки
HLA	Человеческий лейкоцитарный антиген
Ig	Иммуноглобулин
Na-ФСБ	Натрий-фосфатный буфер
NK	Натуральные киллеры
RBC	Эритроциты
АГ	Антиген
АМК	Атакующий мембранный комплекс
АТ	Антитело
В-Л	В-лимфоциты
ГКГС	Главный комплекс гистосовместимости
ИК	Иммунокомплекс
ИКК	Иммунокомпетентные клетки
ИЛ	Интерлейкин
ИНФ	Интерферон
ИФА	Иммуноферментный анализ
МАТ	Моноклональные антитела
МПА	Мясо-пептонный агар
НСТ	Нитросиний тетразолий
ПХ	Пероксидаза хрена
РБТЛ	Реакция бласттрансформации лимфоцитов
СК	Система комплемента
Т-Л	Т-лимфоциты
TNF	Туморнекротизирующий фактор

Лабораторная работа № 1.

Рисунок 1.1. Оснащение иммунодиагностической лаборатории в зависимости от этапов и задач исследования

Мытье лабораторной посуды. Посуда для целей иммунодиагностики должна быть чистой физически, химически и бактериологически. Общие этапы подготовки посуды могут быть сведены к следующему: обеззараживание после контаминации микроорганизмами – обработка детергентами - стерилизация. Стеклянную посуду моют различными способами:

1) очищают механическим путем с помощью ершей. Ерш не должен царапать стенки и дно. После механической обработки посуду обрабатывают химическим путем: погружают в мыльный раствор, смешанный с раствором соды или тринатрийфосфата на ночь;

2) погружают на ночь в 3-5% гипохлорита натрия или 4-10% перекиси водорода. В результате происходящей окислительной реакции от поверхности сосудов отслаиваются остатки органических загрязнений, что позволяет не применять механическую обработку ершом и избежать дополнительной деформации поверхности посуды;

3) для первичной обработки сильно загрязненной посуды, за исключением работы с культурами клеток, может применяться хромовая смесь.

Затем посуда моется горячим (+ 50 – 56 °С) раствором детергента с нейтральным значением рН- 7.0. После мытья посуду необходимо прополоскать большим количеством горячей проточной воды (8-10 кратным объемом) и таким же объемом дистиллированной воды (допустимо замачивать посуду в дистиллированной воде, но не более, чем на 2 часа). В случае защелачивания поверхности стекла посуду следует замочить на 2 часа в 1-4% растворе аскорбиновой или лимонной кислоты, после чего снова прополоскать большим количеством дистиллированной воды. Вымытая посуда должна быть сразу же высушена при температуре не превышающей 120º С. Высушенная посуда должна быть защищена от попадания пыли и загрязнений, для чего ее следует завернуть в специальную плотную бумагу или фольгу и подвергнуть стерилизации. Укупорка сосудов – пробки или завинчивающиеся крышки – подвергаются такой же обработке как и стеклянная посуда: 1) укупорку на этапе мытья с детергентом и последующим полосканием можно подвергнуть кипячению; 2) после мытья укупорку следует рассортировать по размерам и разложить в чашки Петри, после чего завернуть чашки в бумагу или фольгу; стерилизовать только автоклавированием в течение 30 мин при температуре 121 ºС.

 

 

Таблица 1.1

Подготовка крови для изучения параметров иммунитета

 

Периферическую кровь для иммунодиагностического исследования, как правило, забирают из локтевой вены путем венепункции стерильным шприцем или специальными вакуумными контейнерами. Кровь должна быть взята для исследования утром, натощак. Однако при экстренной необходимости данным правилом пренебрегают. Так как иммунодиагностическое исследования включает определение параметров ИКК крови и иммуноактивных молекул (гуморальных факторов), то кровь забирают в 2 пробирки в соответствии с рисунком 1.2.

 

Рисунок 1.2. Схема забора крови для иммунодиагностических исследований

 

Как правило, для иммунологического исследования при венепункции забирают 10 мл крови: 5 мл для исследования клеток и 5 мл – для исследования гуморальных факторов. В принципе, объем крови, необходимый для исследования, различен и зависит от используемых в лаборатории методов и оборудования, а также собственно от диагностических тестов (примеры приведены в таблице 1.2).

Таблица 1.2.

Получение сыворотки крови

 

Взятый у пациента образец крови помещают в сухую чистую пробирку для образования сгустка, т.е. свертывания крови. Этот процесс осуществляется в течение 30-60 мин при инкубации образца при комнатной температуре или при 37º С. После образования сгустка, его отделяют от стенок пробирки, обводя сухой стеклянной палочкой, центрифугируют 10 минут при 350 - 400 g (1500 об/мин) и полученную сыворотку отбирают в чистую пробирку. Сыворотку во избежание эффекта действия неоднок­ратных замораживаний и размораживаний в случае длительного хранения разливают в несколько микропробирок и хранят при -20 °С.

Методы сепарации клеток

 

Многие иммунодиагностические методы нуждаются в очищенной от ненужных типов клеток суспензии. Поэтому особое значение имеют методы сепарации клеток из порции периферической крови (или другого биологического материала). В принципе, все методы сепарации можно условно разделить на три большие группы в соответствии с рисунком 1.3. Эти методы часто дополняют друг друга и используются в комплексе. Комбинация методов сепарации клеток регламентируется задачами диагностической процедуры. В настоящее время разработаны модификации практически всех методик исследования клеток с использованием разных методов сепарации или вовсе без них.

При проведении сепарации клеток нужно учитывать:

1) существенные потери клеток, причем не только в количестве, но и в качестве. Так, ряд функциональных состояний клеток (активация, патологические изменения) сопровождается увеличением их чувствительности к физико-химическим воздействиям, приводящим к разрушению этих клеток и выведению их из-под контроля диагностического теста, а значит – и к утрате диагностически важной информации;

2) изменения функциональных характеристики клеток в процессе сепарации, что также изменяет диагностическое значение полученных результатов.

Среди методов сепарации (выделения, разделения, сортинга) клеток используются различные принципы и соответствующие им методы в соответствии с таблицей 1.3.

 

Рисунок 1.3. Основные методы сепарации клеток

Таблица 1.3

Таблица 1.4

Рисунок 1.4 Седиментация клеток периферической крови при центрифугировании на градиенте плотности

 

Градиенты бывают одноступенчатые, как приведенный выше пример, когда используется градиент с одной плотностью, и двух- или трехступенчатый. В последнем случае используют 2 – 3 градиента с различной плотностью, причем на дно пробирки наливают градиент с более высокой плотностью, а на него – градиент с меньшей плотностью. Центрифугирование на 2 – 3-х ступенчатом градиенте позволяет выделить большее количество популяций лейкоцитов, однако, технически такой способ более сложный.

Рисунок 1.5. Принцип иммуномагнитной клеточной сепарации

 

 

Содержание отчёта

Составьте протокол в соответствии с предложенными заданиями. Приведите расчетные данные, зарисуйте необходимые схемы. Представьте результаты количественного определения популяций клеток.

Контрольные вопросы

1. Оснащение иммунологической лаборатории и особенности приобретения реактивов и оборудования для целей исследований иммунного статуса

2. Правила техники безопасности при работе с биологическим материалом.

3. Методы утилизации биологического материала

4. Цели и задачи иммунодиагностики

5. Биологически среды, в которых присутствуют молекулы и клетки иммунной системы

6. Виды биологических материалов и их использование для иммунологических/иммунодиагностических исследований.

7. Принципы фракционирования биологических материалов.

8. Процедуры предподготовки клеток к иммунологическим исследованиям.

9. Методы разделения клеточных суспензий на градиентах плотности.

10. Методы сепарации клеточных суспензии с использованием моноклональных антител.

Литература

1. Приказ министерства здравоохранения Республики Беларусь «Об утверждении расчетных норм времени на проведение клинических лабораторных исследований» №103 от 10.05.2001 г./ Национальный реестр нормативных актов Республики Беларусь.

2. Примерная организация городской амбулаторно-поликлинической организации/Методические рекомендации. А.К. Цыбин, К.А. Мовчан, А.А. Гракович, И.В. Малахова, Э.А. Вальчук, Н.М. Трофимов и др. – Минск, 2004. – 223 с.

3. Приказ министерства здравоохранения Республики Беларусь «Об утверждении расчетных норм времени на проведение клинических лабораторных исследований» №103 от 10.05.2001 г./ Национальный реестр нормативных актов Республики Беларусь

4. Указ Президента Республики Беларусь «О государственных закупках» от 25. 08.2006 г. №529 / Национальный реестр нормативных актов Республики Беларусь

5.Методы культивирования клеток: Сборник науч. Трудов. – Л.: Наука, 1988. – С.30-38.

6. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

7. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

8.Лабораторный практикум по гематологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Тарасова Е.Е. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2007– 44 с.

9. Тетрадь для лабораторных работ по экспериментальной иммунологии (для специализации «медико-биологическое дело») / Т.Р. Романовская - Минск: МГЭУ им.А.Д.Сахарова, 2006. - 20с.

 

Лабораторная работа № 2.

Таблица 2.1.

Таблица 2.2

Комплемента

Принцип метода заключается в использовании специальных реагентов (R). Реагент представляет собой сыворотку крови человека (приготавливают из пула сывороток крови, т.е. из смеси сыворотки крови, полученных от многих доноров), из которой физико-химическим методом избирательно удален конкретный компонент комплемента. В этом случае добавление реагента к исследуемым образцам сыворотки крови ограничивает активацию комплемента только тем содержанием компонента, который присутствует в исследуемом образце, а значит – определяет уровень гемолитической активности комплемента в целом (рисунок 2.1).

 

 

Рисунок 2.1 Схема определения функциональной активности С2

Содержание отчета

Приведите расчетные данные по выполнению задания 1. Проанализируйте диагностическое значение полученных результатов.

Приведите заключения по предложенным для решения задачам.

Контрольные вопросы

1. Система комплемента, состав, особенности биосинтеза.
2. Пути активации системы комплемента. Функции компонентов и субкомпонентов комплемента. Регуляция активности системы комплемента.
3. Физиологическая и патофизиологическая роль системы комплемента.

Литература

1. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

2. Лабораторный практикум по гематологии ля студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Тарасова Е.Ф и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2007– 44 с.

3. Kirschfinr M. /DMW: Dtsch. Med. Wochenschr. – 1994 – 119 - №9 – p. 307-310

4. Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, 2nd ed, pp. 149-153 (1961).

5. Ляликов Ю. С., Физико-химические методы анализа, 5 изд., М., 1974.

Лабораторная работа № 3.

Рисунок 3.1 Рассеяние света при различных соотношениях размера частиц d и длины волны электромагнитного излучения X

 

Схема анализатора - нефелометра представлена на рисунке 3.2.

 

Рисунок 3.2. Принципиальная схема нефелометра

1- источник световой энергии; 2-полосовой фильтр; 3-кювета; 4-фотоприемник; Ф_о -падающий поток световой энергии; Ф_р-поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Δλ-полоса пропускания светофильтра

Турбидиметрический метод анализа. Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Несмотря на то, что в отношении определения концентрации Ig метод нефелометрии более чувствителен, преимуществом турбидиметрического анализа является возможность проведения измерения практически на любом колориметре или фотометре. Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований, показаны на рисунке 3.3. Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, похожи и включают источник света, фильтр и фокусирующую световой поток систему линз, кювету с образцом и детектор с устройствами отображения и регистрации результата. В качестве источника света обычно используются ртутные дуговые лампы, вольфрамо-йодистые лампы и гелий-неоновые лазеры. Лазеры излучают монохроматический свет, сконцентрированный в узкий и интенсивный луч.

Рисунок 3.3. Схема, иллюстрирующая направления светового потока

При турбидиметрии

1-источник световой энергии; 2-полосовой фильтр, в некоторых случаях фильтр отсутствует, и измерение проводится в «белом» свете; 3-кювета; 4-фотоприемник; Ф₀ -падающий поток световой энергии; Ф_р -поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Ф-поток световой энергии, прошедший раствор; Δλ — полоса пропускания светофильтра

 

Индикаторные методы

К группе индикаторных методов относятся иммунохимические методы определения концентрации Ig, использующие в качестве меченых агентов различные варианты маркерных веществ, позволяющих количественно регистрировать с высокой точностью образовавшиеся комплексы «АГ-АТ».

Радиоиммунный анализ (РИА). Этот высокочувствительный метод разработан более 40 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого АГ с АТ.

Принцип метода заключается в следующем: 1) известное количество АТ смешивают с известным количеством меченого АГ и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество АГ); 2) АГ, содержащийся в пробе, и стандартный меченый АГ связываются с АТ, 3) чем выше содержание немеченого АГ, тем меньше меченого АГ свяжется с АТ.

Концентрацию АГ в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности ИК. Тот же подход может быть использован для определения концентрации АТ в пробе. В этом случае известное количество АГ смешивают с известным количеством стандартных меченых АТ и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество АТ). Другая модификация метода основана на иммобилизации АГ или АТ на твердой подложке.

Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В середине 60-х годов для идентификации и локализации АГ в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). В настоящее время иммуноферментные методы анализа являются наиболее широко используемыми в лабораторной практике.

Основные принципы ИФА:· комплекс АГ-АТ можно выявить, если ввести в состав одного из участников иммунной реакции - ковалентно присоединить - одну или несколько молекул фермента. Причем процесс конъюгирования с ферментом ни на промежуточных (в процессе конъюгирования), ни на финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с ферментом) не должен изменять иммунные свойства фермент-меченого участника иммунной реакции;· проявление ИК осуществляется с использованием способности фермента расщеплять субстрат, который при ферментативной модификации изменяет свой цвет. Способ детекции – спектрофотометрический;· ИК можно выявлять как в растворе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на твердом носителе.

Выделяют следующие виды ИФА: твердофазный (иммобилизированные антитела сорбированы на твердом носителе, например, полистерольном планшете), гомогенный (в гомогенном растворе), флуоресцентный (с использованием флуоресцентных меток). В зависимости от стадийности выполнения различают прямой, непрямой ИФА и ИФА с комплементом.

В иммунодиагностике ИФА нашел широкое применение для количественного анализа субклассов Ig. Иммуноферментный анализ, основе которого лежит применение антител, связанных с ферментом, в англоязычной литературе получил название ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

 

А. Приготовление реагентов

Иммобилизация анти- IgG1 антител

В лунки полистирольного планшета вносится раствор анти- IgG1 антител в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (Na-ФСБ), в количестве 200 мкг на лунку и инкубируется в течение 24 часов при температуре +4^оС. Несорбированный АГ удаляется трехкратным промыванием планшета дистиллированной водой.

Б. Выполнение анализа

Содержание отчета

Зарисуйте необходимые схемы и графики.

Приведите расчетные данные по определенным количественным параметрам результатов ИФА.

Проанализируйте диагностическое значение полученных результатов.

Контрольные вопросы

1 Структура молекулы АТ. Функции отдельных участков молекулы Ig

2. Нормативные показатели концентрации Ig разных классов сыворотки крови человека

3. Физиологическое и патофизиологическое значение Ig разных классов

4. Методы определения концентрации основных изотипов иммуноглобулинов (реакция простой радиальной иммунодиффузии по Манчини).

5. Реакции серологического метода и их значение в детекции антител.

Литература

1. Пиккеринг У.Ф., Современная аналитическая химия, пер. с англ., М., 1977

2. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов, методические указания. Новик А.А., Цыган В.Н., Никитин В.Ю., Соколова Е.Д., Жданов К.В.,

3. Огарков П.И., Лобзин Ю.В.,Жоголев К.Д., Малышев В.В.,ТокмаковВ.С., Сухина И.А. Издательство: Министерство обороны РФ, Главное Военно-Медицинское управление, Москва, 2002.Страницы: 74.

4. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

5. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

6. Crowther, J. R. 1995. ELISA. Theory and Practice. Methods Mol. Biol. 42:1-223.

Engvall, E., and P. Perlmann. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. I mmunochem.8:871-874.

7. Scheffold A, Kern F. Recent developments in flow cytometry. J Clin Immunol. 2000;20:400

8.Kirschfinr M. /DMW: Dtsch. Med. Wochenschr. – 1994 – 119 - №9 – p. 307-310

Лабораторная работа № 4

Таблица 4.1.

Таблица 4.2

Рисунок 4.1 Схема флуоресцентного клеточного сортера «FACS II»

 

В этом случае метод не только даст информацию о процентном содержании клеток, экспрессирующих определенный рецептор, но определяет число клеток, несущих сочетание 2-4 маркеров (разрабатываются системы для одновременного учета 7-11 маркеров!). Эти современные методы позволяют давать комплексную оценку иммунологического фенотипа ИКК, причем система учета автоматизирована и объективна.

Собственно процедура иммунофенотипирования иммунокомпетентных клеток заключается в постановке реакции иммунофлуоресценции. При учете на люминесцентном микроскопе маркирование клеток МАТ проводят, используя очищенную от других типов клеток суспензию мононуклеаров и вариант непрямой РИФ. При учете на проточном цитофлуориметре чаще маркирование проводят с использованием цельной крови в варианте прямой РИФ.

Протокол постановка прямой РИФ

(с регистрацией на цитофлуориметре)

Реакцию проводят на выделенной из крови суспензии мононуклеаров в концентрации 2,5-5,0×10⁶ клеток/мл или с использованием цельной крови.

1. В пластиковую пробирку (12×75 мм) вносят 100 мкл крови, добавляют 10 мкл МАТ, меченных флуорохромом, тщательно перемешивают и инкубируют в темноте при комнатной температуре 30 минут.

2. В образец вносят лизирующий RBC раствор (0,84 М NH₄Cl в буферном растворе) на 3 – 5 минут, затем добавляют 2 мл PBS.

3. Центрифугируют пробирку, отбирают супернатант, а к осадку клеток добавляют 0,5 мл 2% раствора параформальдегида.

4. Регистрируют реакцию на проточном цитофлуориметре.

 

Содержание отчёта

Зарисуйте необходимые схемы и микроскопические изображения розеткообразующих клеток. Приведите расчетные данные по полученным результатам.

 

Контрольные вопросы

1.Субпопуляционная дифференцировка ИКК на основе мембранных рецепторов

2.Функции основных мембранных рецепторов лимфоцитов. Основные стадии лимфопоэза и смена мембранных маркеров лимфоцитов в процессе лимфопоэза и иммуногенеза

Литература

1. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. – М.- Витебский мединститут, 1996. – 282 с.

2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

3. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

4. Givan AL. Principles of flow cytometry: an overview. Methods Cell Biol. 2001;63:19-50.

Лабораторная работа № 5.

Рисунок 5.1 Основные стадии фагоцитарной реакции

 

Интегральной характеристикой функционального состояния нейтрофилов является оценка их фагоцитарной активности in vitro на основании определения фагоцитарное индекс Гамбургера, фагоцитарного числа Райта, коэффициента фагоцитарного числа и опсонического индекса поглощения. Тем не менее, выявление дисфункций отдельных этапов фагоцитоза также может иметь диагностическое значение. Для этого оценивают такие параметры как адгезивная, миграционная и метаболическая активность, хемилюминесцентной способности, скорость поглощения кислорода и ее изменение в тестах со специфической лекарственной нагрузкой.

Рисунок 5.1 Исследования миграционной активности нейтрофилов под агарозой

5. В центральные лунки вносят по 10 мкл суспензии НФ в концентрации 10⁷ кл/мл, в один столбец из боковых лунок – 10 мкл среды RPMI-1640, во второй столбец боковых лунок – 10 мкл стимулятора (например, fMLP - 10^-5М) в соответствии с рисунком 5.1.

6. Чашки инкубируют при 37˚С в течение 90 минут.

7. После окончания инкубации в чашки заливают по 4 мл 10% раствора формалина и оставляют при комнатной температуре в течение 30 минут.

8. Формалин сливают и осторожно удаляют слой агарозы.

9. Чашки промывают бидистиллированной водой и высушивают на воздухе.

10. Окраску клеток можно проводить красителем Романовского-Гимзы.

11. Учет результатов проводят с использованием микроскопа с окуляром-микрометром. Измеряют длину пробега клеток по направлению к среде и длину пробега клеток к хемоаттрактанту. Вычисляют индекс миграции – отношение длины пробега клеток к хемоаттрактанту к длине пробега клеток к среде.

Нормальные значения: индекс миграции к FMLP 2,6-2,8 к ИЛ-8 - 1,7-3.

Оценка функциональной активности нейтрофилов на различных стадиях фагоцитоза in vitro методом оксиграфии (методика апробирована Лебедевой А.К., Вишневской Ю.А., МГЭУ им. А.Д. Сахарова, г. Минск, Беларусь, 2007г.)

Эффективное протекание фагоцитарной реакции обеспечивается взаимодополняющим функционированием кислород-зависимых и кислород-независимых систем. При этом важная роль внешнего кислорода определяется в первую очередь его участием в процессе генерации активных кислородных радикалов, обладающих бактериоцидной активностью. В связи с эти потребление кислорода нейтрофилами, вступившими в фагоцитоз, увеличивается от 2 до 20 раз. Изменение содержания растворенного кислорода в среде в процессе фагоцитоза может быть определено методом окиграфии. Оксиграфия – это кинетический метод, в основе которого лежит постоянная регистрация изменения содержаний кислорода в среде в течение времени, что позволяет выявить нарушение различных этапов фагоцитоза разнесенных во времени: передачи активационного сигнала – генерацию активных форм кислорода – поглощение микроорганизма. Исследование проводят следующим образом:

1. Включить оксиграф. Ячейку оксиграфа заполнить дистиллированной водой и произвести калибровку прибора в соответствии с температурой воздуха и атмосферным давлением. Выставить нулевое значения путем добавления к дистиллированной воде дитионита натрия в концентрации 17,5 мМ,что позволяет полностью связать растворенный кислород.

2. Промыть ячейку оксиграфа дистиллированной водой и внести в нее 300 мкл культуры дрожжей в растворе Хенкса в концентрации 1×10⁹ КОЕ/ мл.

3. Добавить к культуре дрожжей 300 мкл плазмы. Дождаться полной стабилизации уровня кислорода.

4. Внести в ячейку 300 мкл суспензии нейтрофилов в растворе Хенкса в концентрации 2,5 млн/мл.

Мониторинг содержания кислорода проводят в течении 30 мин. Для линейного участка кривой поглощения рассчитывается скорость потребления кислорода, как отношение количества поглощенного кислорода ко времени, в течение которого это поглощение произошло. Степень завершенности фагоцитоза контролировали путем приготовления и последующего микрокопирования мазков инкубируемой суспензии.

Новые возможности для выявления молекулярных механизмов дисфункций нейтрофилов методом оксиграфии появляются при создании дополнительной лекарственной нагрузки in vitro. Для этого могут быть использованы селективные блокаторы ионных каналов лидокаин и верапамил.

Литература

1. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. – М.- Витебский мединститут, 1996. – 282 с.

2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

3.Гребенюк А.Н., Антушевич А.Е., Беженарь В.Ф. Нейтрофилы и экстремальные воздействия, СПб., 1998.-216с.

4. Кетлинский С. А, Калинина Н. М. Иммунология для врача. С.-П.: Наука, 1998. 142-143с.

Лабораторная работа №6.

Таблица 6.1

Гистосовместимости

Области медицины Показатели	Трансплантология	Диагностика аутоиммунных заболеваний
Спектр определяемых параметров	Типирование проводится в отношении максимально большого количества определяемых молекул/генов ГКГС	Проводится определение лишь тех конкретных молекул ГКГС, которые связаны с развитием диагностируемого заболевания
Решаемые задачи	Позволяет определить совместимость пары донор-реципиент и минимизировать возможность развития отторжения трансплантата	Позволяет определить генетическую предрасположенность к развитию заболевания, либо подтвердить диагноз

 

Методы типирования антигенов HLA (или ГКГС человека) условно можно разделить на 2 группы: оценка антигенной специфичности молекул HLA (А) и и идентификация локусов генов, характерных для индивидуума (В), в соответствии рисунком 6.1.

А.Определение антигенов HLA реципиента:

Серологические методы

Основной серологический метод типирования антигенов HLA – лимфоцитотоксический тест. Метод заключается в следующем: 1) к сывороткам против разных антигенов HLA добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов; 2) после инкубации добавляют комплемент (его источником может служить кроличья сыворотка); 3) лимфоциты, несущие антиген, против которого направлена сыворотка, под действием комплемента разрушаются; 4) затем к лимфоцитам добавляют краситель, который окрашивает только живые клетки. Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов. Основным недостатком является большой требуемый объем крови: для типирования антигенов класса I необходимо не менее 15 мл, а для типирования антигенов класса II – не менее 30 мл крови. Получение диагностических сывороток – трудоемкий и дорогостоящий процесс. Он сводится к исследованию большого количества проб сывороток от многорожавших женщин с помощью панелей лимфоцитов, типированных по антигенам HLA. Особенно трудно получить сыворотки к редким антигенам HLA. При оценке результатов серологического типирования антигенов HLA необходимо учитывать, какая лаборатория его проводила и качество используемых сывороток. Наименее доступны сыворотки к антигенам HLA класса II, особенно к антигенам HLA-DP.

Все варианты постановки тестов на комплементзависимую цитотоксичность (лимфотоксичность) основаны на использовании микротехники, предложенной американским исследователем П. Терасаки: шестиствольный шприц для раскапывания сывороток, шприц для раскапывания комплемента, одноствольный шприц с диспенсером, планшет Терасаки, планшет Меллера для техники двойной флуоресцентной окраски. Пластиковые микропробирки для разлива сывороток (1 мл) и комплемента (2 мл).

 

Рисунок 6.1. Основные направления исследования главного комплекса

Гистосовместимости

Литература

1.Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. – М.Ж Медицина, 1983, 208 с.

2. Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell. Molecular Cell Biology, 5th Edition, ©2003 W. H. Freeman & Co.

Лабораторная работа №7.

Таблица 7.1

Рисунок 7.1

Рисунок 7.2 Основные феномены пролиферации лимфоцитов и методы регистрации

Таблица 7.2

Таблица 7.3.

Рисунок 7.3 Схема оценки цитотоксической активности NK

Радиоизотопным методом

Таблица 7.3

В камерах Перфильева

 

капилляр	Соотношение клеток	Количество К-562	Количество лимфоцитов
№1	1:10	10 мкл	25 мкл
№2	1:20	10 мкл	50 мкл
№3	1:30	10 мкл	100 мкл
№4	1:40	10 мкл	200 мкл
№5 (контроль, спонтанная гибель)	-	10 мкл	-

 

 

Литература

1. Методы культивирования клеток: Сборник науч. Трудов. – Л.: Наука, 1988. – С.30-38.

2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

3. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

4. Лимфоциты - методы (ред. Д. Клаус) Москва, "Мир" 1990, с. 52-53

 

 

Лабораторная работа № 8.

Таблица 8.1

Рисунок 8.1 Принципиальная схема исследования продукции цитокинов в условиях in vitro

Литература

1. Методы культивирования клеток: Сборник науч. Трудов. – Л.: Наука, 1988. – С.30-38.

2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

3. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.

4. Лимфоциты - методы (ред. Д. Клаус) Москва, "Мир" 1990, с. 52-53

5. А.А.Ярилин. Основы иммунологии: Учебник, - М.: Медицина, 1999. – 608 с.

6. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов, методические указания. Новик А.А., Цыган В.Н., Никитин В.Ю., Соколова Е.Д., Жданов К.В., Огарков П.И., Лобзин Ю.В., Жоголев К.Д., Малышев В.В., ТокмаковВ.С., Сухина И.А. Издательство: Министерство обороны РФ, Главное Военно-Медицинское управление, Москва, 2002.Страницы: 74

7. Crowther, J. R. 1995. ELISA. Theory and Practice. Methods Mol. Biol. 42:1-223.

8. Engvall, E., and P. Perlmann. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. I mmunochem.8:871-874.