Вопрос№21. Иммунологические методы в вирусологических исследованиях

Иммунологические методы исследования — диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, а также в научно-исследовательской работе. Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность И. м. и. превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах. С помощью И. м. и. определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов И. м. и. позволяют определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.

В зависимости от их механизма и учета результатов И. м. и. можно подразделить на реакции, основанные на феномене агглютинации; реакции, основанные на феномене преципитации; реакции с участием комплемента; реакция нейтрализации; реакции с использованием химических и физических методов.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген — антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

 

 

Вопрос№22. Типы симметрии вирусов (кубический, спиральный, смешанный). Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот при упаковке геномов вирусов.

В зависимости от взаимодействия капсида с НК частицы вирусов могут быть подразделены на несколько типов симметрии:

1). Кубический тип симметрии.

Кубические капсиды представляют собой косайдеры обладающий примерно 20-ю треугольными поверхностями и 12 вершинами. Они формируют напоминающую сферическое образование структуру, но на самом деле это многогранник. В ряде случаев к вершинам таких косаэдрических многогранников прикрепляются особые липопротеиновые образования именуемые шипами. Роль этих шипов предположительно сводится к взаимодействию вирионов или вирусных частиц с соответствующими участками чувствительных к ним клеток хозяев. При кубической симметрии вирусная нуклеиновая кислота уложена плотно (свернута в клубок), а белковые молекулы окружают ее, образуя многогранник (икосаэдр). Икосаэдр – многогранник с двадцатью треугольными гранями, имеющий кубическую симметрию и приблизительно сферическую форму (рис. 27). К икосаэдрическим вирусам относятся вирус простого герпеса, реовирусы и др.

2). Спиральный тип симметрии. Спиральные капсиды устроены несколько проще. Т е капсомеры составляющие капсид покрывают спиральную НК и формируют тоже достаточно стабильную белковую оболочку этих вирусов. И при использовании высокоразрешающих электронных микроскопов и соответствующих методов приготовления препарата можно видеть спирализованные структуры на вирусах. При спиральной симметрии капсида вирусная нуклеиновая кислота образует спиральную (или винтообразную) фигуру, полую внутри, и субъединицы белка (капсомеры) укладываются вокруг нее тоже по спирали (трубчатый капсид) (рис. 26). Примером вируса со спиральной симметрией капсида является вирус табачной мозаики, который имеет палочковидную форму, а его длина составляет 300 нм с диаметром 15 нм. В состав вирусной частицы входит одна молекула РНК размером около 6000 нуклеотидов. Капсид состоит из 2000 идентичных субъединиц белка, уложенных по спирали.

3 ). Смешанный или сложный тип симметрии. Как правило, такой тип симметрии выявляется главным образом среди бактериальных вирусов. И классическими примерами служат те фаги, кишечной палочки или умеренные фаги. Это сложные образования, имеющие головку с внутренним нуклеиновым содержимым, различного рода придатки, хвостовой отросток, разной степени сложности устройства. И каждый компонент таких частиц наделён определённой фунцкией, реализующейся в процессе взаимодействия вируса с клеткой. Иными словами сложный тип симметрии представляет собой сочетание кубической симметрии, головка – это многогранник косайдер и палочковидные образования – это хвостовые отростки. Хотя среди вирусов бактерий существуют тоже довольно просто организованные вирионы которые являются примитивными нуклеокапсидами, сферической или кубической формы. Наиболее сложно устроенными являются вирусы бактерий, по сравнению с вирусами растений и вирусами животных.

 

 

Вопрос№23. Генетическая организация и цикл репликации вирулентных фагов Т4, Т7. Жизненный цикл бактериофага, который заканчивается разрушением клетки (как правило) и выходом сформированных фаговых частиц в окружающую среду называется литическим циклом. Бактериофаги, размножающиеся только литическим путем, называются вирулентными. Типичными представителями вирулентных фагов являются Т-четные колифаги. У фагов отсутствуют какие-либо приспособления для активного поиска хозяина в окружающей среде, их взаимодействие с чувствительными бактериальными клетками происходит при случайных столкновениях в ходе броуновского движения. Чем выше степень разведения смеси фагов и чувствительных клеток, тем ниже вероятность их случайного столкновения, и, соответственно, ниже вероятность повторной инфекции. Адсорбция и проникновение фага в клетку-хозяина. Бактериофаги взаимодействуют с клеточными поверхностями не случайным образом, а в особых рецепторных сайтах. В качестве рецепторов для фагов могут выступать различные компоненты клеточной поверхности – липополисахариды, белки внешней мембраны, тейхоевые кислоты, жгутики, пили. Наличие этих компонентов в клетках бактерий определяет их чувствительность к разным фагам, а также специфичность фагов в отношении клеток-хозяев. Процесс проникновения и репродукции в бактериях наиболее всего изучен у группы Т-четных фагов, в частности у колифага Т4. Рецепторами для адсорбции этого фага на клеточной поверхности E. coli служат липополисахариды и некоторые белки внешней мембраны. Непосредственно с рецепторными сайтами клеток обратимо взаимодействуют хвостовые нити фага Т4, за счет возникающего между ними электростатического притяжения (поэтому на процесс адсорбции фага влияет рН среды и наличие двухвалентных катионов типа магния и кальция). Одна из моделей, описывающих такое взаимодействие, предполагает, что в процессе обратимой адсорбции отдельные длинные хвостовые нити фага связываясь и освобождаясь случайным образом позволяют фагу как бы «шагать» по поверхности клетки до того момента, пока он на окажется в оптимальном положении для закрепления, затем связывание становится необратимым. Некоторые данные электронной микроскопии показывают, что в области адгезии фага внутренняя и внешняя мембраны сливаются (образуются зоны Байера), хотя непонятно, является ли это результатом прикрепления, или фаг просто распознает эти участки каким-то образом.

Прочно связанные с рецепторами хвостовые нити надежно закрепляют базальную пластинку на поверхности клетки, такое оптимальное расположение фага индуцирует конформационные изменения в структуре сократимого чехла (и базальной пластинки тоже), в результате этого белковая «пробка», закрывающая отверстие внутреннего полого стержня удаляется, и наружный чехол сокращается, укорачиваясь почти в два раза. Поскольку фаг прочно закреплен на клеточной поверхности, то в результате сокращения чехла внутренний полый стержень пронзает стенку бактерии насквозь, формируя нечто вроде поры между внутренней полостью фаговой частицы и цитоплазмой клетки. Через этот полый стержень двуцепочечная фаговая ДНК вводится в клетку-хозяина при помощи вспомогательных белков (gp5 и gp27). Для того чтобы ДНК фага наиболее эффективно проникала в клетку, необходим протонный градиент на плазматической мембране, направленный внутрь клетки. Однако такой градиент лишь вспомогательный механизм, оптимизирующий инъекцию ДНК, поскольку фаги Т4 способны инфицировать лишенные клеточной стенки протопласты бактерий и в отсутствие такого градиента.

Рисисунок 5. Адсорбция фага Т4 на поверхности E. coli и введение фаговой ДНК.

Внутриклеточная репродукция фага. В геноме фага Т4 обнаружено около 300 открытых рамок трансляции (ORF, от англ. open reading frame), причем плотность расположения генов значительно выше чем у E. coli (95% процентов последовательности ДНК кодируют какие-либо продукты). После проникновения фаговой ДНК в клетку-хозяина, гены фага начинают транскрибироваться, не все сразу, а в определенной последовательности. Такую очередность обеспечивают модификации РНК-полимеразы клетки-хозяина и вирусные сигма факторы, определяющие взаимодействие этого фермента с нужными промоторами на каждом этапе. Для более эффективного контроля переключения, гены фага Т4 (и многих других фагов) организованы в модули, или кластеры, в соответствии с их назначением (хотя и не все) – так, например, группируются гены лизиса, гены белков головки, хвостового отростка, гены репликации ДНК и т.п. В соответствии с временными рамками функционирования генов все их можно разделить на четыре группы: предранние (30 секунд), ранние (2 минуты), средние (3 минуты), поздние (12 минут). Фактически, разница между предранними и ранними генами только в их положении – ранние расположены за 3`-концом предранних генов и отделены от них одним или несколькими ρ-зависимыми терминаторами (иногда ранние гены могут содержать собственные промоторы). Для осуществления транскрипции ранних генов фаг Т4 использует два пути с участием различных вспомогательных белков: транскрипция с индивидуальных промоторов ранних генов и антитерминация транскрипции при синтезе с промоторов предранних генов.

Структура промоторов фаговых генов в определенной степени отличается от промоторов E. coli (кроме ранних и предранних генов, которые имеют идентичные им промоторы), причем отличия существуют и между отдельными группами генов фага. Поэтому, как уже упоминалось, в ходе репродуктивного цикла фага РНК-полимераза клетки-хозяина подвергается определенным модификациям, необходимым для переключения генов. Уже через 2 минуты после инъекции фаговой ДНК РНК полимераза E. coli начинает транскрипцию ранних генов фага Т4 с использованием обычной σ⁷⁰ субъединицы. Один из ферментов (белок Alt), кодируемых ранними генами, осуществляет перенос АДФ-рибозильной группы из кофермента НАД на одну из α-субъедиц РНК-полимеразы – такая модификация резко снижает сродство бактериальной РНК-полимеразы к последовательностям промоторов генов хозяина и увеличивает экспрессию вирусных генов.

Ранние фаговые гены кодируют белковые факторы и ферменты, которые перенаправляют метаболизм клетки-хозяина на производство фагового потомства. Синтез ДНК, РНК и белков хозяина останавливается полностью, фаговые нуклеазы расщепляют хромосомную ДНК с образованием пула предшественников для синтеза ДНК фага, который начинается через 5 минут после инфицирования клетки. Перенос АДФ-рибозильной группы на вторую субъединицу РНК-полимеразы E. coli. прерывает транскрипцию некоторых ранних фаговых генов, а продукт одного из ранних генов motA стимулирует транскрипцию средних генов, модифицируя определенным образом РНК-полимерзу, и одного позднего гена, кодирующего сигма фактор gp55 (от англ. gene product). Данный сигма фактор вместе с другими дополнительными белками (gp33, gp45) необходим для транскрипции поздних генов фага Т4, которая начинается через 12 минут после инъекции фаговой ДНК. Два белка – gp44 и gp62 – катализируют формирование тримерного комплекса из белка gp45 в специальных энахансерных сайтах, которые представляются собой, как ни странно, ники или одноцепочечные бреши в структуре ДНК. Данный тример подвижен и называется соответственно «скользящий зажим». Он функционирует как усилитель процессивности ДНК-полимерзы фага Т4 (мультидоменный белок похожий на ДНК полимеразу I E. coli), а также способен присоединять сигма субъединицу фага Т4 gp55 и комплекс из РНК-полимеразы и белка gp33, катализируя формирование открытого промоторного комплекса в соответствующих участках промоторов поздних генов. Транскрипция поздних генов происходит сопряжено с репликацией ДНК фага после образования конкатемернов, причем репликативная вилка может выступать в качестве подвижного энхансера, поскольку в ее состав входят белки «скользящего зажима».

ДНК фага Т4 реплицируется в линейной форме в двух направлениях с одного ориджина. В процессе репликации концевые участки лидирующих цепей остаются одноцепочечными ввиду того, что размера оставшегося на конце участка не хватает для постановки праймера. Эти участки лидирующих цепей участвуют в рекомбинации с образованием D-петель, а в результате рекомбинационных процессов образуются дополнительные репликативные вилки, в которых собирается реплисома и инициируются новые циклы репликации. Добавочные однонитевые участки, образуемые нуклеазами фага, служат участками для рекомбинации и затравками для инициации дополнительного синтеза ДНК за пределами ориджина, итогом всего этого является формирование многочисленных разветвленных конкатемерных комплексов.

Линейная ДНК фага Т4 содержит на концах т.н. концевые избыточности – это идентичные группы генов, фланкирующие его геном. В концевых избыточностях могут быть представлены любые фаговые гены. Объем головок фага Т4 рассчитан на упаковку количества ДНК, составляющего 102% от размера полного генома бактериофага, т.о. при заполнении проголовки конкатемеры нарезаются так, что в головке оказывается фрагменты, на 2% большие чем полный геном – в итоге у всех формирующихся фаговых частиц при сходном порядке расположения генов в ДНК, последовательности, фланкирующие геном, будут разные.

Сборка фаговых частиц. Формирование фаговых частиц – процесс довольно сложный. С 12-ой минуты после проникновения ДНК фага в клетку начинается транскрипция поздних генов, которые кодируют три типа белков: компоненты фаговой оболочки, белки, помогающие в сборке фаговых частиц, но не включающиеся в состав зрелых фагов, и белки, обеспечивающие лизис клетки и освобождение фагового потомства. Все структурные белки оболочки фага синтезируются одновременно, но сборка основных фаговых компонентов (головка, базальная пластинка и т.д.) происходит по отдельности и в определенном порядке. Сначала образуется базальная пластинка из 15 различных белков, затем на ней, как на платформе, формируется внутренний полый стержень, а вокруг него сократимый чехол. Сборка проголовки или прокапсида происходит отдельно из, примерно, 10 белковых субъединиц, при помощи специальных стыковочных белков (scaffold proteins). В основании проголовки находится специальный портальный белок, являющийся частью системы, обеспечивающей транслокацию ДНК в головку и обратно, а также участвующей в сборке головки. После заполнения фаговой ДНК зрелая головка спонтанно соединяется с хвостовым отростком, и лишь затем к этому комплексу присоединяются хвостовые нити.

 

Высвобождение фагового потомства. Лизис клетки-хозяина происходит примерно через 25 минут после инфицирования. Два белка обеспечивают разрушение бактериальной клетки и выход фагового потомтсва – эндолизин, разрушающий пептидогликановый слой, и холин, формирующий поры в цитоплазматической мембране, предоставляя доступ эндолизину к пептидогликановому слою.

 

 

Различают несколько фаз продуктивной инфекции, сопровождающейся размножением вирионов; фаза прикрепления и проникновения; эклипс-фаза, или фаза затмения; фазы синтеза ранних ферментов и компонентов фага; сборки и выхода фагов из бактерий.При эффективном взаимодействии фаги эшерихий адсорбируются на липопротеидных (Т-2, Т-6) или липосахаридных (Т-3,Т-4, Т-7) рецепторах, а простые по строению фаги, как правило, лизирующие только мужские особи бактерий, - на пилях. При этом на рецепторах и пилях могут адсорбироваться десятки фаговых частиц»
однако продуктивную инфекцию чаще всего вызывает лишь одна из них, а точнее, - ее нуклеиновая кислота (НК).

Распознаются рецепторы нитями базальной пластинки Т-четного колифага. Вслед за этим под влиянием выделяемого фагом лизоцима в клеточной стенке эшерихий образуется отверстие,через которое посредством сокращения оболочки головки и чехла в цитоплазму вталкивается кончик стержня и из него в цитоплазму бактерии проникает ДНК с несколькими молекулами небольших пептидов и белков, предохраняющих ее от бактериальных эндонуклеаз (рестриктаз).

Фаги, прикрепляющиеся к пилям бактерий, вводят свою нук-
леиновую кислоту через их канал; возможно, он используется
как всасывающий механизм целых вирионов или же с пил ей, как
с трамплина, они соскальзывают к оболочке клеток.

После введения в клетку фаговой ДНК следует эклипс-фаза,
в которой обнаружить фаг невозможно. В этой фазе происходят
синтез эндонуклеаз, разрушающих ДНК клетки-хозяина, образо-
вание ферментов, катализирующих биосинтез промежуточных
продуктов ДНК фагов и ферментов репликации, которые совме-
стно с клеточной ДНК-полимеразой обеспечивают репликацию

Вопрос№24. Взаимодействие фага с клеткой. Вирулентные и умеренные фаги. Адсорбция. Взаимодействие начинается с прикрепления вирусных частиц к клеточной поверхности. Процесс становится возможным при наличии соответствующих рецепторов на поверхности клетки и анти-рецепторов на поверхности вирусной частицы. Вирусы используют рецепторы клетки, предназначенные для транспорта необходимых веществ: питательных частиц, гормонов, факторов роста и т.п. Рецепторы: белки, углеводный компонент белков и липидов, липиды. Специфические рецепторы определяют дальнейшую судьбу вирусной частицы (транспорт, доставка в участки цитоплазмы или ядра). Вирус может прикрепляться и к неспецифическим рецепторам и даже проникать в клетку. Однако такой процесс не вызывает развития инфекции. Вначале происходит образование единичной связи антирецептрора и рецептора. Такая связь непрочная и может разрываться. Для образования необратимой адсорбции необходимо мультивалентное прикрепление. Стабильное связывание происходит благодаря свободному перемещению молекул рецепторов в мембране. При взаимодействии вируса с клеткой наблюдается увеличение текучести липидов, и формирование рецепторных полей в области взаимодействия вируса и клетки. Рецепторы ряда вирусов могут быть представлены лишь в ограниченном наборе клеток-хозяев. Этим и определяется чувствительность организма к данному вирусу. Таким образом, вирусная ДНК и РНК обладает способностью инфицировать более широкий круг клеток-хозяев. Антирецепторы могут находиться в составе уникальных вирусных органелл: структуры отростка у Т-бактериофагов, фибры у аденовирусов, шипы на поверхности вирусных мембран, корона у коронавирусов. Проникновение. 2 механизма – рецепторный эндоцитоз и слияние мембран. У фагов только НК. Механизм проникновения не известен. Рецепторный эндоцитоз: Обычный механизм поступления в клетку питательных и регуляторных веществ. Происходит в специализированных участках - где имеются специальные ямки, покрытые клатрином, на дне ямки располагаются специфические рецепторы. Ямки обеспечивают быструю инвагинацию и образование покрытых клатрином вакуолей. (с момента адсорбции проходит не более 10 мин, за одну минуту может образоваться до 2000 вакуолей). Вакуоли сливаются с более крупными цитоплазматическими вакуолями, образуя рецепторосомы (уже не содержат клатрин), которые в свою очередь сливаются с лизосомами. Слияние вирусной и клеточной мембран: У оболочечных вирусов слияние обусловлено точечными взаимодействиями вирусного белка с липидами клеточной мембраны, в результате чего вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной. У безоболочечных вирусов один из поверхностных белков также взаимодействует с липидами клеточных мембран и внутренний компонент проходит через мембрану (у парамиксовирусов – F-белок, у ортомиксовирусов – HA2 гемагглютинирующая субъединица). На конформацию поверхностных белков влияет рН. Раздевание. При этом процессе исчезает инфекционная активность, часто появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к антителам. Конечный продукт раздевания – нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Стадия раздевания является так же лимитирующей возможность инфекции (вирусы способны раздеваться не в каждой клетке). Раздевание происходит в специализированных участках клетки: лизосомы, аппарат Гольджи, околоядерном пространстве.Раздевание проходит в результате ряда реакций. Например, у пикорнавирусов раздевание идёт с образованием промежуточных субвирусных частиц с размерами от 156 до 12S. У аденовирусов в цитоплазме и ядерных порах и имеет как минимум 3 стадии: - образование субвирусных частиц с большей плотностью, чем вирионы;- образование сердцевин, в которых отсутствует 3 вирусных белка;- образование ДНК-белкового комплекса, в котором ДНК ковалетно соединена с терминальным белком. Характеристика вирулентных и умеренных фагов.

При заражении бактерии фагом имеет место так называемая литическая инфекция т.е инфекция завершающаяся лизисом клетки хозяина, но это свойственно только так называемым вирулентным фагам, взаимодействие которых с клеткой приводит к гибели клетки и формированию фагового потомства. При этом различают следующие этапы по взаимодействиям фага с клеткой: смешивание фага с культурой клеток (множественность инфецирования 1 фаг на 10 клеток), причём концентрация должна быть достаточно высокой, с тем чтобы имелась возможность контактирования фагов с клетками. Чтобы не было повторного заражения – после инфицирования в течение 5 минут максимум, когда фаги адсорбируются – разводится эта смесь клеток с фагом с тем чтобы не было повторных заражений при выходе фагового потомства. Выделяется латентный период в течение, которого количество фага не увеличивается, затем очень короткий период выхода, когда резко повышается количество фаговых частиц, когда клетка лизируется и высвобождается фаговое потомство и потом кол-во фагов остаётся на одном уровне, потому что повторного заражения не происходит. На основании этой кривой можно выделить вот эти фазы: вегетативный период «роста» (латентный период), период выхода и рассчитать урожайность фага на 1-у инфицированную клетку. На протяжении латентного периода не удается обнаружить в бактериях ничего похожего на фаговые частицы и не удаётся выделить из таких клеток находящихся в латентном периоде инфекционное начало. Только зрелые фаговые частицы способны вызвать заражение бактерий. Таким образом, вирулентные фаги всегда вызывают гибель бактерий и продуцируют инфекцию, выявляющуюся в продуцировании новых вирусных частиц способных инфицировать следующие и другие чувствительные к ним клетки.

В отличие от вирулентных, заражение умеренными фагам не приводит к лизису бактериальных клеток, а реализуется становление особого состояния сосуществования фага с бактериальной клеткой. Это сосуществование выражается в том, что некое начало фага присутствует в бактериальной клетке без всяких неблагоприятных условий для нее и сохраняется из поколения в поколение. На определенных этапах такого сосуществования фаг активируется в клетке и переходит в состояние литического цикла развития, вызывая лизис клетки и высвобождения фагового потомства. Такие фаги получили название лизогенезирующих или умеренных фагов, а состояние умеренного существования с фагом лизогенией, а бактерии, которые содержат в себе такой скрытый фаг - лизогенных бактерий. Термин лизогенные бактерии происходил из того, что когда-то были обнаружены культуры, у которых спонтанно появлялся фаг, и этот бактериафаг стал рассматриваться как загрязнение культуры, то есть в культуру попадает бактериальный вирус, и такие культуры получили название лизогенных, то есть они генерируют лизис.

Вопрос№25. Три состояния бактериофага. Механизмы лизогенизации и индукции профага лямбда. Вирион,Профаг,Вегетативный фаг

Развитие умеренных фагов (лизогения) подробно охарактеризовано для колифага λ. Это сложный фаг, содержащий линейную двухцепочечную ДНК. На 5/-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последовательность из 12 нуклеотидов – липкие концы (cos -сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку, липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клетки-хозяина и образуется кольцевая молекула.Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому. Установлено, что гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI) блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный белок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступления ДНК фага λ в клетку, выбор между литическим и лизогенным путями развития зависит от относительной скорости накопления регуляторных белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то развиваются события литического цикла, если успевает проявиться функция репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как белок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя транскципции фаговых генов.Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому осуществляется согластно интегративной модели А.Кемпбелла. Этот процесс называется сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal и bio и не зависит от rec A -системы бактериальной клетки.

За интеграцию ДНК фага λ ответственен фермент лямбда-интеграза. Этот фермент узнает две разные последовательности – одну в хромосомной ДНК (att λ), а другую в ДНК фага (b2). Затем происходит разрыв обеих молекул ДНК и последующее их перекрестное воссоединение.

После этого ДНК фага λ реплицируется с клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при делении получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом. Состояние лизогении поддерживается благодаря постоянному образованию белка-репрессора сІ, и довольно неустойчиво: в любой момент может произойти переключение на литический путь из-за проявления антирепрессорных функций белка Cro. Показано, что в популяции лизогенных бактерий в одной из 102 – 105 клеток происходит спонтанная индукция профага и запускается литический цикл, а такие клетки подвергаются лизису. Эффективность данного процесса зависит как от состояния бактерии-хозяина, так и действия разнообразных физических и химических факторов. Индукторами перехода лизогения ↔ литический цикл являются ультрафиолетовое излучение, митомицин С, алкилирующие агенты, для некоторых фагов также и изменение температуры.

Явление индукции профага очень важно учитывать при составлении многокомпонентных заквасок для получения молочнокислых продуктов. Если среди штаммов, входящих в такие закваски окажутся лизогенные и нелизогенные, но чувствительные к фагу, обусловившему лизогению бактерий, то произойдет явление фаголизиса (т.е. гибели клеток), очень опасное для молочной промышленности.__ Следует отметить, что фаголизис может быть обусловлен и вирулентными фагами, попадающими в технологические потоки при плохой организации производства. Явление фаголизиса так же может наблюдается и в процессе микробного синтеза аминокислот, что значительно снижает рентабельность этих отраслей биотехнологии.

Таким образом, умеренные бактериофаги могут находиться в трех состояниях:

- в свободном состоянии в виде частиц – вирионов;

- в состоянии профага;

- в вегетативном (активном) состоянии, когда бактериофаг способен вызывать лизис бактериальной клетки

 

 

Вопрос№26. Бактериофаги как переносчики генетической информации бактерий. Фаговая трансдукция и фаговая конверсия. Бактериофаги – многочисленная группа, поражающая все известные группы бактерий.

Фаги, как и вирусы позвоночных, беспозвоночных и расте­ний, по содержанию нуклеиновых кислот подразделяются на ДНК- и РНК-содержащие, а по характеру взаимодействия с бактериями - на вирулентные и умеренные с полноценным и де­фектным геномами.

Различают простые и сложные фаги. При этом простые имеют форму шестигранников (колифаги MS-2, f2, фХ174) или нитей (фаги fl, fd), а сложные (колифаги группы Т1-Т7) - сперматозоидную.

Приобретение новых признаков, обусловленных профагом, называется фаговой (лизогенной) конверсией. Фаговая конверсия может затрагивать такие важные свойства бактерий как морфология колоний, биохимические признаки, способность синтезировать токсины или антибиотики, устойчивость к лекарственным препаратам и др. Утратившие часть своего генома умеренные фаги становятся дефектными и, будучи не способными к образованию зрелых частиц, осуществляют трансдукцию (лат. transductio - пере­нос, перемещение), т. е. перенос генов.

Трансдукция - вид рекомбинации, при которой перенос гене­тического материала от одних клеток (доноров) к другим (реци­пиентам) осуществляют умеренные фаги или их мутанты.

Установлено, что за трансдукцию ответственны умеренные фаги, потерявшие способность лизогенизировать бактериальные клетки вследствие того, что часть их генома при неправильном отщеплении замещается фрагментом ДНК бактерии-донора. Та­кие мутанты фагов называют дефектными фаговыми корпуску­лами или дефектными фагами. Они всегда присутствуют в попу­ляции фагов, освобождаемых клетками в среду после индукции или суперинфекции. С помощью трансдуцирующего фага могут передаваться многие признаки и свойства: способность сбражи­вать различные углеводы, ситезировать аминокислоты и вита­мины, резистентность к антибиотикам, вирулентность, токси-генность, жгутики. При этом трансдуцирующие свойства фага не зависят от способности лизироватъ или лизогенизировать ре-ципиентную клетку.

Виды трансдукции. По характеру передачи признаков раз­личают три вида трансдукции - генерализованную, ограничен­ную (специализированную) и абортивную.

Генерализованную, или общую, трансдукцию осуществляют фаги с множественной локализацией на хромосоме бактерий. К ним, в частности, относится умеренный фаг Ми-1, содержащий линейную двухцепочечную ДНК.

Ограниченную трансдукцию связывают с фагами, обладаю­щими избирательной локализацией на хромосоме бактерий и способными переносить ограниченное число генов, прилегаю­щих к специфическим участкам интеграции. Этот вид трансдук­ции осуществляют умеренные фаги X, Р2, Р22 и многие другие.

Абортивная трансдукция отличается от первых двух тем, что перенесенный фагом фрагмент ДНК донора остается в ци­топлазме реципиентной клетки в автономном состоянии. Не включаясь в хромосому клетки-реципиента, этот фрагмент ДНК в течение нескольких делений бактерий передается лишь одной клетке, а далее полностью исчезает.

 

 

Вопрос№27. Генетическая организация фага лямбда. Основное отличие – могут быть в 3-х состояниях:

· Вирион

· Вегетативный фаг

· Профаг

Длинный хвостовой отросток, ДНК 2-х цепочечная, линейная внутри головки.

На 5/-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последовательность из 12 нуклеотидов – липкие концы (cos -сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку, липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клетки-хозяина и образуется кольцевая молекула.

Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому. Установлено, что гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI) блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный белок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступления ДНК фага λ в клетку, выбор между литическим и лизогенным путями развития зависит от относительной скорости накопления регуляторных белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то развиваются события литического цикла, если успевает проявиться функция репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как белок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя транскципции фаговых генов.

Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому осуществляется согластно интегративной модели А.Кемпбелла. Этот процесс называется сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal и bio и не зависит от rec A -системы бактериальной клетки.

За интеграцию ДНК фага λ ответственен фермент лямбда-интеграза. Этот фермент узнает две разные последовательности – одну в хромосомной ДНК (att λ), а другую в ДНК фага (b2). Затем происходит разрыв обеих молекул ДНК и последующее их перекрестное воссоединение.

После этого ДНК фага λ реплицируется с клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при делении получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом.