Вопрос№18. Методы получения фаголизатов и их использование на практике..

Фаголизат - суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для этого можно использовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды.Фаголизат получают путем размножения фага на клетках чувствительной культуры. В бульонную культуру бактерий E.coli В вносят 1-2 мл фаговой суспензии либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне. После соответствующего периода инкубирования и просветления суспензии фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним из следующих способов:

· фильтрованием через мембранный фильтр;

· центрифугированием для осаждения клеток (6 тыс. об/мин, 10 мин);

· обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение одной минуты, инкубированием в течение одного часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде. 18-24-часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (Е. coli В) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10 и культивируют с аэрированием при оптимальных условиях (37 °С) до логарифмической фазы роста в течение 2,5-3 ч (до плотности 2-10⁸ клеток/мл). После этого в бактериальную культуру добавляют суспензию фага с таким расчетом, чтобы множественность инфекции составляла единицу, и продолжают инкубирование в течение 6-8 ч с аэрацией до просветления бактериальной культуры.

Фаголизат освобождают от бактерий низкоскоростным центрифугированием (6 тыс. об/мин, 10 мин) или фильтрованием через бактериальные фильтры и определяют титр полученного фага.В жидкой среде можно получать большие объемы фаголизатов с со­ержанием фаговых частиц около 5-10⁹ в 1 мл.Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы с использо­анием агаризованной питательной среды. Этот метод, предложенный М. Сванстромом (М. Swanstrom) и М. Адамсом (М. Adams) в 1951 г., за­лючается в лизисе фагом густой суспензии чувствительных бактерий в слое полужидкого агара, В 3 мл 0,7%-й агаризованной питательной среды вносят 0,1 мл культуры чувствительных бактерий Е. coli В в логарифмической фазе роста и 1 мл суспензии одного из фагов Т-группы (конечная концентрация 10⁴-10⁵ частиц/мл), перемешивают и выливают на поверхность 1,5%-й агаризованной питательной среды в чашках Петри. Таким образом проводят засев нескольких чашек. Чашки инкубируют в течение 18-20 ч, а затем в каждую из них вносят 5 мл физиологического раствора или жидкой питательной среды и шпателем осторожно снимают верхний (0,7%-й) слой агара. Для удаления бактерий и остатков агара полученную массу центрифугируют (6 тыс. об/мин, 10 мин). После серии разведений полученного фаголизата определяют титр фага.

Экспериментально выявлено, что на плотной питательной среде количество полученного фаголизата оказывается меньше, чем в случае приготовления его в жидкой питательной среде, но титр бактериофага в этом случае несколько выше - 10⁹—10¹¹ частиц/мл.

Вопрос№19. Лабораторные животные и растения, используемые в вирусологических исследованиях. Использование культур клеток для изучения вирусов животных. Вирусы составляют особое царство Vira, занимающее промежуточное положение между живой и неживой природой, и характеризуются чрезвычайно малыми размерами (10-300 нм в диаметре), облигатным внутриклеточным паразитизмом, отсутствием самостоятельных белок-синтезирующих и генерирующих энергию систем. Особенностью их размножения является раздельный синтез вирусных компонентов (нук­леиновой кислоты и белков) в живой клетке с последующим соединением их в зрелые вирусные частицы.Вирусы могут существовать в трех формах - вириона, провируса и в репродуктивной форме. Вирион представляет собой внеклеточную покоящуюся форму вируса, выполняющую функцию переноса его генома из одной клетки в другую. Провирус - это форма интеграции генома не­которых вирусов с геномом клетки-хозяина, при которой репродукции вируса не происходит. Репродуктивная форма вируса соответствует внутриклеточной стадии его развития.

По способности заражать клетки выделяют вирусы человека и животных, растений и микроорганизмов. Всем им присущ ряд свойств, отличающих их от всех других форм жизни, поэтому для их выделения и идентификации применяют особые методы. Культивирование вирусов животных требует использования эмбрионов птиц, лабораторных животных, культур животных клеток. В вирусологической практике применя­ются как первичные культуры клеток, полученные с помощью разрушения межклеточных контактов преимущественно эмбриональных тканей протеолитическими ферментами (трипсином), так и культуры переви­ваемых линий клеток, источником которых являются клетки опухолевых или нормальных тканей, дополнительно обработанные трансформирующими агентами и обладающие способностью к росту в течение неограниченного периода времени в условиях субкультивирования.

Методика трипсинизации тканей и получение однослойных культур клеток была предложена в 1952 г. Р. Дульбекко (R. Dulbecco) и М. Фогт (М. Vogt). Культивируемые клетки животных выращивают в виде однослойной культуры в стеклянных или пластмассовых плоскостенных сосудах - матрацах. Среда для выращивания клеток содержит различные макро- и микроэлементы, углеводы, нуклеозиды, незаменимые аминокислоты, витамины, гормоны (инсулин, глюкокортикоиды и т. д.), ростовые факторы (факторы роста нервов, фибробластов и др.). Часто в качестве источника вышеперечисленных соединений к средам добавляется эмбриональная телячья сыворотка.

Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференцировки ткани. Чем меньше степень дифференцировки ткани, тем более интенсивной способностью к пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбрионов и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Наибольший ростовой потенциал у тканей эмбриона свойствен клеткам соединительной ткани, а у взрослых животных - эпителиальным клеткам.

В качестве примера культур перевиваемых клеток, нашедших наибольшее применение в вирусологии, можно привести клетки, полученные из нормальных тканей: FL (из амниона человека), Rh (из почки че­ловека), ВНК-21 (из почки сибирского хомячка) и др.; из клеток злокачественных тканей: HeLa, Нер-1 (из шейки матки человека), Нер-2 (из гортани человека), J-96 (из лейкоцитов человека) и др.

При использовании для культивирования вирусов эмбрионов птиц суспензию вируса наносят на хорион-аллантоисную оболочку, вводят в аллантоисную или амниотическую полость либо в желточный мешок. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку применяют в тех случаях, когда вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы, герпесвирусы, вирус лейкоза кур и др.), в аллантоисную полость - при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (например, вирус гриппа). Заражение в амниотическую полость является самым эффективным методом для выделения ряда орто- и парамиксовирусов, в желточный мешок - для культивирования поксвирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.).

Лабораторных животных используют главным образом для выделения вирусов, не вызывающих видимых изменений в культуре клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах (вирус Коксаки А, возбудитель лимфоцитарного менингита и др.).

 

 

Вопрос№20. Структура вирусных частиц: сердцевина вируса и капсид (нуклеокапсиды), оболочки вирионов и их происхождение. Антирецепторы вирусов. Уже было отмечено, что вирусная частица состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белка. Белковая оболочка, которая окружает нуклеиновую кислоту, называется капсидом. Капсид каждого вируса состоит из отдельных субъединиц – капсомеров. Капсиды некоторых вирионов окружены дополнительной мембраной. Если вирус имеет мембрану, то говорят, что он «в оболочке» или окружен суперкапсидом, при отсутствии мембраны вирус называют «раздетым» или «голым».

Капсид чаще всего имеет симметричное строение. Различают два типа симметрии – спиральную и кубическую. При спиральной симметрии капсида вирусная нуклеиновая кислота образует спиральную (или винтообразную) фигуру, полую внутри, и субъединицы белка (капсомеры) укладываются вокруг нее тоже по спирали (трубчатый капсид) (рис. 26). Примером вируса со спиральной симметрией капсида является вирус табачной мозаики, который имеет палочковидную форму, а его длина составляет 300 нм с диаметром 15 нм. В состав вирусной частицы входит одна молекула РНК размером около 6000 нуклеотидов. Капсид состоит из 2000 идентичных субъединиц белка, уложенных по спирали.

При кубической симметрии вирусная нуклеиновая кислота уложена плотно (свернута в клубок), а белковые молекулы окружают ее, образуя многогранник (икосаэдр). Икосаэдр – многогранник с двадцатью треугольными гранями, имеющий кубическую симметрию и приблизительно сферическую форму. К икосаэдрическим вирусам относятся вирус простого герпеса, реовирусы и др.

В зависимости от типа симметрии вирусы подразделяют на: вирусы со спиральным типом симметрии, вирусы с кубическим типомсимметрии и сложные вирусы, имеющие оба типа симметрии и состоящие из икосаэдрической головки и хвоста. Примером сложных вирусов являются колифаги Т2, Т4 (т.е. бактериофаги, инфицирующие клетки бактерий E.coli) и др. У некоторых сложных вирусов икосаэдрический капсид заключает в себе трубчатый нуклеокапсид.

В зависимости от того, какой тип нуклеиновой кислоты содержится в вирусной частице, их подразделяют на 2 группы:

- ДНК-содержащие, имеющие в качестве генетического материала либо одно-, либо двухцепочечную ДНК, которая может быть как линейной, так и кольцевой. Примером ДНК-содержащих вирусов являются колифаги Т2, Т4, λ; вирус простого герпеса; вирус оспы и др.

- РНК-содержащие вирусы, генетическая информация которых закодирована в РНК. РНК также может быть как одно-, так и двухцепочечной. Вирусы с одноцепочечной РНК можно разделить, в свою очередь, на 2 типа: с «плюс»-цепью РНК и с «минус»-цепью РНК. У вирусов первого типа цепь РНК может функционировать в клеткехозяине непосредственно как информационная РНК, тогда как у вирусов второго типа на «минус»-цепи должна сначала с помощью клеточных РНК-полимераз синтезироваться «плюс»-цепь РНК, которая и служит информационной РНК. Примером РНК-содержащих вирусов являются реовирусы, вирус гриппа, ретровирусы и др.

В зависимости от организма хозяина выделяют вирусы, поражающие животных и человека, растения и микроорганизмы.

Вирусы растений иначе называются фитопатогенными вирусами. Эти вирусы попадают внутрь растительных клеток через повреждения или с помощью переносчиков насекомых или нематод. Фитопатогенные вирусы вызывают у растений множество болезней. Особенно большой вред приносят вирусы, поражающие картофель.

У человека вирусы вызывают множество заболеваний, включая оспу, грипп, корь, свинку, инфекционный гепатит, желтую лихорадку, полимиелит, герпес, бешенство, СПИД, раковые заболевания и др. Многие вирусные заболевания у человека и животных можно предупредить путем иммунизации. Вирусные заболевания поддаются лечению с трудом, так как вирусы не чувствительны к большинству антибиотиков. Вирусы животных и человека передаются при контакте, либо с помощью насекомых-переносчиков, а также через объекты окружающей среды.

Вирусы бактерий называются бактериофагами. Вероятно, в природе не существуют бактерии, которые не поражались бы одним из типов бактериофагов. Бактериофаги могут наносить вред производству, основанному на жизнедеятельности бактерий.