Снижение способности митохондрий накапливать кальций

Параллельно разобщению окислительного фосфорилирования наблюдается потеря способности митохондрий к накоплению ионов кальция. В присутствии избытка субстратов дыхания и при наличии кислорода и ортофосфата митохондрий печени способны накопить в матриксе количество фосфорнокислого кальция, по массе превышающее массу митохондрий в сотни и даже в тысячу раз! Повреждение митохондрий приводит к падению разности потенциалов на митохондриальной мембране. Положительно заряженные ионы кальция, удерживаемые в матриксе электрическим полем, начинают выходить наружу из поврежденных митохондрий. Способность митохондрий накапливать ионы кальция в присутствии субстратов и кислорода хорошо видна в опытах по измерению флуоресценции суспензии этих органелл, к которой добавлен флуорофор – антибиотик тетрациклин (еще лучше – хлортетрациклин, ХТ). Дело в том, что хлортетрациклин связывает ионы Ca²⁺, образуя флуоресцирующий комплекс. Но в водной среде квантовый выход этой флуоресценции довольно низкий, и комплекс флуоресцирует слабо. При переносе кальция в матрикс (в отсутствие фосфата!) его концентрация во внутренней митохондриальной мембране повышается (см. объяснение на рис. 3). На рис. 4 приведены результаты опыта, в котором к митохондриям в среде инкубации, содержащей субстраты, но не содержащей фосфата и АДФ, добавляли небольшие порции CaCl₂. На введение первой порции митохондрии ответили усилением дыхания и ростом флуоресценции тетрациклина. Вторая порция кальция оказала меньший эффект, последующие добавки эффекта не вызывали, но вместо этого из митохондрий начал выходить кальций (падение флуоресценции), органеллы стали набухать (снижение светорассеяния) и дыхание стало расти, свидетельствуя об увеличении проницаемости мембран в состоянии 2 по Чансу. По-видимому, способность митохондрий аккумулировать кальций была ограничена, и в конце концов произошло повреждение митохондрий и выход кальция. Максимальная амплитуда, которая достигается суспензией, соответствует максимальному количеству кальция, которое могут поглотить митохондрии в отсутствие фосфата. Эта величина была названа "кальций- аккумулирующей способностью" митохондрий. Она, как и коэффициент дыхательного контроля, снижается при повреждении митохондрий и может служить показателем их интактности. На рис. 5 показано, что при небольшом повреждении митохондрий происходит частичное снижение этого показателя. При полном повреждении митохондрий возрастания флуоресценции при добавлении кальция к митохондриям вообще не происходит (на рисунке не показано). При тканевой гипоксии происходит параллельное снижение дыхательного контроля и кальций-аккумулирующей способности митохондрий, как это видно на рис. 2. Разобщение окислительного фосфорилирования и выход кальция из митохондрий имеют самые драматические последствия для клетки. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению ионных насосов, выходу калия и вхождению ионов натрия и кальция в клетку из окружающей среды. Одновременная потеря митохондриями способности аккумулировать кальций приводит к тому, что попавший в клетку кальций ими также не удаляется. Это в свою очередь приводят к активации целого комплекса ферментных систем, активируемых ионами кальция, включая фосфолипазы, многие системы биосинтезов и протеинкиназы; метаболизм клетки вначале активируется, а затем дезорганизуется. Именно повреждение митохондрий является, согласно современным представлениям, тем переломным моментом, после которого изменения в клетке, вызванные повреждающим агентом, становятся необратимыми и клетка погибает.

Набухание митохондрий

Весьма важным морфологическим признаком повреждения митохондрий является их набухание. Набухание митохондрий наблюдается, например, в клетках миокарда при недостаточности сердца, а также при многих инфекционных, гипоксических, токсических и других патологических процессах. Набухание митохондрий происходит при помещении клеток в гипотоническую среду, под влиянием ионизирующей радиации, бактериальных токсинов, при действии химических ядов и других патогенных агентов на клетку. Набухание приводит сначала к разрывам наружных мембран митохондрий, а затем – к их полному разрушению. В опытах с изолированными митохондриями показано, что существует два типа набухания: пассивное и активное. В противоположность клеточным мембранам, сравнительно хорошо проницаемым для ионов K⁺ и Cl^-, внутренние мембраны митохондрий непроницаемы для заряженных частиц (ионов), за исключением ионов Ca²⁺ и, возможно, ионов железа. В изотоническом растворе KCl неповрежденные митохондрии сохраняют свой объем, несмотря на то, что концентрация ионов калия и хлора внутри существенно меньше, чем снаружи: осмотическое давление внутри создается и другими ионами, а также белками матрикса. При одновременном увеличении проницаемости для ионов калия и хлора они начинают диффундировать в митохондрию, что приводит к повышению внутри осмотического давления, входу воды и набуханию органелл, которое называется пассивным, т. к. не зависит от дыхания и энергизации. К агентам, вызывающим пассивное набухание, относятся ионы тяжелых металлов, включая ртуть, серебро, свинец. Таким же действием обладает далеко зашедшее перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий. В условиях живой клетки чаще имеет место иной тип набухания - активное набухание (см. рис. 6), связанное с работой цепи переноса электронов. Повреждение митохондрий под действием малых доз тяжелых металлов, активации собственной фосфолипазы в условиях гипоксии, при перекисном окислении липидов - сопровождается, прежде всего, повышением проницаемости внутренней мембраны для катионов. В присутствии источников энергии (субстраты дыхания и кислород, АТФ) на мембранах митохондрий генерируется разность потенциалов величиной около 170-180 мВ со знаком "минус" в матриксе, под действием которой ионы K⁺ поступают внутрь поврежденных митохондрий. Вместе с калием в матрикс поступает ортофосфат, который переносится в электронейтральной форме через внутреннюю мембрану с помощью специального белкового переносчика. Активное (т.е. связанное с затратой энергии) накопление фосфата калия в матриксе сопровождается набуханием митохондрий. Набухание митохондрий изучают довольно простым методом, измеряя светорассеяние суспензии в режиме турбидиметрии (на пропускание) или нефелометрии (измеряется рассеянный свет). При набухании митохондрий светорассеяние суспензии уменьшается, а пропускание – увеличивается. Пример записи набухания митохондрий приведен на рис. 7. Набухание митохондрий – не только следствие, но и причина их дальнейшего повреждения. Это хорошо видно из данных опыта, где набухание митохондрий и растяжение их мембран вызывали помещением органелл в гипотонические среды (см. рис. 8). Таким образом, само по себе растяжение мембраны, какими бы причинами они ни было вызвано, приводит сначала к повреждению наружной мембраны, а затем – к обратимому нарушению свойств мембраны внутренней.

Вопросы для самоконтроля

1. Как изменяется потребление кислорода в разных функциональных состояниях митохондрий при аноксии? Объясните наблюдаемые явления.

2. Как изменяется способность митохондрий аккумулировать ионы кальция при аноксии? Метод и результаты опытов.

3. Какие причины могут вызвать изменение объема митохондрий? Набухание митохондрий при аноксии и реоксигенации, причины этого явления.

4. Влияние набухания митохондрий на их функции.

 

Лекция 4

Роль кальция и фосфолипазы А₂ в повреждении митохондрий при гипоксии