Основные изменения в клетках при повреждении

Основные изменения в клетках при повреждении

Введение

Нарушение жизнедеятельности организма человека при заболевании всегда, так или иначе, связано с изменением функционирования клеток. При этом нарушение функций одних клеток может быть первопричиной развития болезни в целом, тогда как состояние других клеток может быть нарушенным вследствие неблагоприятных изменений в организме, связанных с развитием патологического процесса. Например, при инфаркте миокарда происходит нарушение функционирования, а затем и гибель клеток сердечной мышцы вследствие острого недостатка кислорода. В результате того, что часть сердечной мышцы не участвует в сокращении, нарушается кровоснабжение организма, которое может привести к серьезной гипоксии и нарушению функций клеток других органов: почек, мозга, печени. При многих интоксикациях первично повреждаются клетки печени или почек, а нарушение функционирования этих органов сопровождается отравлением других клеток организма продуктами метаболизма. Первично или вторично повреждение клеток, оно в любом случае неблагоприятно отражается на состоянии организма и должно быть ликвидировано как можно быстрее. Но для того чтобы найти правильное средство предупреждения или защиты клеток от нарушения их функций, надо знать, почему и как повреждаются клетки в живом организме.

Что мы называем повреждением клетки?

Нарушение функционирования клетки, вызванное действием неблагоприятных факторов, например недостатком кислорода или действием токсических соединений, может вначале и не привести к повреждению клетки: как только восстановятся нормальные окружающие условия, клетка вновь вернется в состояние, близкое к исходному.

Повреждением называется ухудшение функционирования клетки, которое сохраняется после удаления повреждающего агента.

Серьезное повреждение клетки может привести к развитию процессов, приводящих к ее гибели. Часто это связано с включением специального механизма апоптоза (запрограммированной смерти клетки), о котором будет сказано позже. Незапрограммированную смерть клетки называют некрозом.

Первичное, специфическое действие повреждающих факторов на клетки

Повреждение клетки выражается в определенном нарушении ее структуры и функций. При этом различные повреждающие факторы вызывают неодинаковые специфические первичные нарушения в клеточных структурах. В таблице 1 перечислены некоторые агенты, способные оказывать прямое повреждающее действие на клетки.

Нарушение функций клеточных структур

В таблице 2 перечислены изменения в свойствах отдельных клеточных структур, которые наблюдаются на ранних стадиях развития неспецифической реакции клеток на повреждение.

Таблица 2. Ранние изменения в функционировании внутриклеточных структур при повреждении клетки

Явление	Проявление
Увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны	Увеличение электропроводности; Увеличение связывания красителей; Снижение мембранного потенциала; Выход ионов калия из клетки; Выход метаболитов; Увеличение объема (набухание) клеток; Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция.
Нарушение структуры и функций митохондрий	Снижение потребления кислорода; Увеличение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны; Набухание митохондрий; Снижение кальций-аккумулирующей способности.
Ацидоз
Повреждение эндоплазматического ретикулума
Изменение активности ферментов и рецепторов	Активация ферментов лизосом; Активация эндонуклеаз -> апоптоз.
Повреждение генетического аппарата клетки	Повреждение рибосом.

 

Увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны

Выход ионов калия из клеток

При активно работающей Na⁺-K⁺-АТФазе на клеточной мембране поддерживается разность потенциалов, со знаком минус внутри клетки, под действием которой ионы калия входят в клетку. Этот постоянный поток K⁺ внутрь компенсирует спонтанный выход калия наружу, который происходит в силу диффузии этих катионов из области с более высокой концентрацией калия в область с более низкой его концентрацией. Повреждение клетки сопровождается снижением содержания АТФ в клетке, падению потенциала на цитоплазматической мембране и выходу калия из клеток. Освобождение калия из тканей в кровь описано при механической травме, различных интоксикациях, аллергических состояниях, гипоксии и многих других повреждениях органов и тканей. Понижение содержания ионов калия в клетке может происходить также под влиянием больших доз минералокортикоидных гормонов, при действии некоторых лекарственных веществ, например сердечных гликозидов. В свою очередь, увеличение концентрации калия во внеклеточной среде приводит к снижению мембранного потенциала соседних клеток, что в случае электровозбудимых тканей может привести к генерации потенциалов действия. Так увеличение концентрации калия в очаге инфаркта миокарда может стать одной из причин возникновения фибрилляции сердца.

Выход метаболитов

Увеличение проницаемости мембран клеток и ухудшение работы насосов приводит к тому, что компоненты цитоплазмы выходят в окружающую среду. Вышедшие из клеток вещества отнюдь не безразличны для других клеток, тканей и органов. Так, среди веществ, выходящих из клеток, поврежденных в результате ишемии (нарушения кровотока) или ожога, имеются полипептиды, обладающие способностью останавливать сокращение сердца (ишемический, ожоговый токсины). Обнаружение этих веществ осуществляется различными методами, включая измерение хемилюминесценции плазмы крови, интенсивность которой снижается в присутствии полипептидных токсинов.

Ацидоз

Любое повреждение клетки сопровождается ацидозом ее цитоплазмы (рН падает до 6 и ниже). Первичный ацидоз повреждения клеток следует отличать от вторичного ацидоза в воспаленной ткани, который возникает значительно позднее (через несколько часов) после нанесения повреждения. Первичный ацидоз повреждения - следствие накопления в клетке определенных продуктов метаболизма, таких как продукт гликолиза - молочная кислота и другие. Первичный ацидоз в поврежденной ткани возникает при действии различных повреждающих агентов: механического воздействия, действия химических агентов (например такого, как горчичное масло), бактериального (дизентерийная палочка, гемолитический стафилококк). Ацидоз повреждения возникает в тканях также при гипоксии.

Активация ферментов лизосом

В поврежденных клетках происходит выход в цитоплазму и активация ряда гидролитических ферментов, в нормальных клетках заключенных в специальные фосфолипидные везикулы - лизосомы. Последние представляют собой образования диаметром порядка 0,4 мкм и содержат такие ферменты как катепсины, рибонуклеазы, кислая фосфатаза, дезоксирибонуклеаза, гиалуронидаза и др. Различные повреждающие агенты, например, эндотоксины бактерий кишечно-тифозной группы, а также мелкие неорганические частицы (двуокись кремния, двуокись титана, алмазная пыль), попадая в лизосомы, разрушают их. Активация лизосомальных ферментов может происходить не только под действием тех или иных специфических факторов, но и в результате ацидоза, характерного для неспецифической реакции клетки на то или иное повреждающее воздействие. Одним из процессов, вызывающих выход лизосомальных ферментов, является также активация пероксидации липидов в лизосомальных мембранах. Пока все еще идет дискуссия о том, является ли активация лизосом механизмом удаления содержимого погибшей клетки или причиной ее повреждения при действии неблагоприятных факторов.

Вопросы для самоконтроля

1. Физико-химические факторы, повреждающие клетку.

2. Стратегия изучения действия неблагоприятных факторов.

3. Универсальный ответ клетки на повреждающе воздействие.

4. Перечислите основные морфологические и функциональные признаки повреждения клеток.

5. Какие изменения в свойствах цитоплазматической мембраны происходят при повреждении клетки?

 

Лекция 2

Набухание митохондрий

Весьма важным морфологическим признаком повреждения митохондрий является их набухание. Набухание митохондрий наблюдается, например, в клетках миокарда при недостаточности сердца, а также при многих инфекционных, гипоксических, токсических и других патологических процессах. Набухание митохондрий происходит при помещении клеток в гипотоническую среду, под влиянием ионизирующей радиации, бактериальных токсинов, при действии химических ядов и других патогенных агентов на клетку. Набухание приводит сначала к разрывам наружных мембран митохондрий, а затем – к их полному разрушению. В опытах с изолированными митохондриями показано, что существует два типа набухания: пассивное и активное. В противоположность клеточным мембранам, сравнительно хорошо проницаемым для ионов K⁺ и Cl^-, внутренние мембраны митохондрий непроницаемы для заряженных частиц (ионов), за исключением ионов Ca²⁺ и, возможно, ионов железа. В изотоническом растворе KCl неповрежденные митохондрии сохраняют свой объем, несмотря на то, что концентрация ионов калия и хлора внутри существенно меньше, чем снаружи: осмотическое давление внутри создается и другими ионами, а также белками матрикса. При одновременном увеличении проницаемости для ионов калия и хлора они начинают диффундировать в митохондрию, что приводит к повышению внутри осмотического давления, входу воды и набуханию органелл, которое называется пассивным, т. к. не зависит от дыхания и энергизации. К агентам, вызывающим пассивное набухание, относятся ионы тяжелых металлов, включая ртуть, серебро, свинец. Таким же действием обладает далеко зашедшее перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий. В условиях живой клетки чаще имеет место иной тип набухания - активное набухание (см. рис. 6), связанное с работой цепи переноса электронов. Повреждение митохондрий под действием малых доз тяжелых металлов, активации собственной фосфолипазы в условиях гипоксии, при перекисном окислении липидов - сопровождается, прежде всего, повышением проницаемости внутренней мембраны для катионов. В присутствии источников энергии (субстраты дыхания и кислород, АТФ) на мембранах митохондрий генерируется разность потенциалов величиной около 170-180 мВ со знаком "минус" в матриксе, под действием которой ионы K⁺ поступают внутрь поврежденных митохондрий. Вместе с калием в матрикс поступает ортофосфат, который переносится в электронейтральной форме через внутреннюю мембрану с помощью специального белкового переносчика. Активное (т.е. связанное с затратой энергии) накопление фосфата калия в матриксе сопровождается набуханием митохондрий. Набухание митохондрий изучают довольно простым методом, измеряя светорассеяние суспензии в режиме турбидиметрии (на пропускание) или нефелометрии (измеряется рассеянный свет). При набухании митохондрий светорассеяние суспензии уменьшается, а пропускание – увеличивается. Пример записи набухания митохондрий приведен на рис. 7. Набухание митохондрий – не только следствие, но и причина их дальнейшего повреждения. Это хорошо видно из данных опыта, где набухание митохондрий и растяжение их мембран вызывали помещением органелл в гипотонические среды (см. рис. 8). Таким образом, само по себе растяжение мембраны, какими бы причинами они ни было вызвано, приводит сначала к повреждению наружной мембраны, а затем – к обратимому нарушению свойств мембраны внутренней.

Вопросы для самоконтроля

1. Как изменяется потребление кислорода в разных функциональных состояниях митохондрий при аноксии? Объясните наблюдаемые явления.

2. Как изменяется способность митохондрий аккумулировать ионы кальция при аноксии? Метод и результаты опытов.

3. Какие причины могут вызвать изменение объема митохондрий? Набухание митохондрий при аноксии и реоксигенации, причины этого явления.

4. Влияние набухания митохондрий на их функции.

 

Лекция 4

Роль кальция и фосфолипазы А₂ в повреждении митохондрий при гипоксии

Вопросы для самоконтроля

1. Расскажите об опытах, показывающих, какую роль играют ионы кальция в повреждении митохондрий при гипоксии.

2. Как было доказано, что фосфолипаза (а) активируется при гипоксии и (б) участвует в повреждении митохондрий?

3. Последовательность событий при тканевой гипоксии.

4. Порочный круг клеточной патологии. Что Вы о нем знаете?

 

Лекция 5

Первичные радикалы

Основные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы ненасыщенных жирных кислот, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Радикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и в ходе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, одно время применявшихся в качестве лекарств.

Активные формы кислорода

Основная масса молекулярного кислорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно восстанавливается до воды, окисляя органические субстраты в цепях переноса электронов. Меньшая часть кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислорода восстанавливается клетками нашего организма до супероксидного радикала. Так клетки – фагоциты (моноциты и гранулоциты крови и тканевые макрофаги) выделяют супероксид в реакции, катализируемой ферментным комплексом – НАДФН-оксидазой:

НАДФН + 2O2 -> НАДФ^+ + 2O^•- (супероксид)

Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной (см. схему на рис. 2). В норме и при отсутствие ионов металлов переменной валентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водорода; эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой (СОД) (реакция 2 на рис. 2):

2O^•- -> H2O2 + O2

Клетки-фагоциты используют перекись водорода, превращая ее в гипохлорит – соединение, разрушающее стенки бактериальных клеток; эта реакция катализируется ферментом миелопероксидазой (реакция 3 на рис. 2):

H2O2 + Cl^- -> H2O + ClO^-

Избыток перекиси водорода удаляется под действием двух ферментов: глутатионпероксидазы или каталазы (реакция 4 на рис. 2):

В условиях патологии могут произойти нарушения либо системы защитных ферментов (в частности, снижение активности СОД), либо ферментных систем, связывающих ионы железа в плазме крови (церулоплазмин и трансферрин) и в клетках (ферритин). В этом случае супероксидные радикалы и перекись водорода вступают в альтернативные реакции: Образование двухвалентного железа из трехвалентного (реакция 7 на рис. 2):

Fe^3+ + O^•- -> Fe^2++ O2

Реакция перекиси водорода и гипохлорита с ионами двухвалентного железа (реакции 9 и 10 на рис. 2):

Fe^2+ + H2O2 -> Fe^3+ + HO^- + HO· (радикал гидроксила)

Fe^2+ + ClO^- + H^+ -> Fe^3+ + Cl^- + HO· (радикал гидроксила)

Совокупность продуктов, образуемых активированными клетками-фагоцитами (радикалы супероксида и гидроксила, перекись водорода и гипохлорит) называют активными формами кислорода; некоторые авторы называют гипохлорит и продукты его метаболизма в тканях (такие как хлорамины R-NHCl) называют активными формами хлора. Радикалы гидроксила химически исключительно активны и вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов биологических мембран. Особенно тяжелые последствия имеют две последние реакции. Радикалы ·OH вызывают разрыв нитей ДНК, обладая, в зависимости от ситуации, мутагенным, канцерогенным или цитостатическим действием. С другой стороны, реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы гидроксила инициируют цепную реакцию их пероксидации (перекисного окисления).

Цепное окисление липидов

См. также соответствующий раздел в лекции №7.

См. также лекцию «Кинетика реакций цепного окисления липидов».

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии, и следует остановиться на ее механизме. Она протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи (см. рис.3 и 4). Рассмотрим эти стадии подробнее.

Инициирование цепи

Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы:

HO· + LH -> H2O + L·

Липидный радикал (L·) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO·):

L· + O2 -> LOO·

Продолжение цепи

Радикал LOO· атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L·:

LOO· + LH -> LOOH + L·

Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов (см. рис.3).

Разветвление цепи

Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe²⁺ c гидроперекисями липидов:

Fe^2+ + LOOH -> Fe^3+ + HO^- + LO·

Образующиеся радикалы LO· инициируют новые цепи окисления липидов (рис. 4):

LO· + LH -> LOH + L·;

L· + O2 -> LOO· -> и т. д.

Обрыв цепей

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe²⁺) или друг с другом:

LOO· + Fe^2+ + H^+ -> LOOH + Fe^3+

 

LOO· + InH -> In· + LOOH

LOO· + LOO· -> молекулярные продукты + фотон

Антиоксиданты водной фазы

Основные реакции в водной фазе, предшествующие цепному окислению, и роль антиоксидантов в ограничении скорости этих процессов можно представить в виде схемы, приведенной на рис. 5. Непосредственными предшественниками гидроксильного радикала, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалентного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит). По этой причине образование радикала гидроксила и пероксидация липидов тормозится веществами, снижающими концентрацию одного из этих двух соединений. К ним относятся:

1. Фермент супероксиддисмутаза, который снижает концентрацию супероксидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы железа хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, образованных субъединицами белка ферритина.

2. Ферменты каталаза и глутатион-пероксидаза, которые удаляют перекись водорода. Эффективность работы глутатион-пероксидазы зависит от концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных радикалов.

Регенерация восстановленного глутатиона (GSH) из окисленного (GSSG) осуществляется за счёт НАДФН; этот процесс катализируется ферментом глутатионредуктазой. Недостаток глутатиона в клетках, например эритроцитах, который может быть обусловлен действием токсических веществ, например ионами тяжелых металлов или наследственным недостатком глутатионредуктазы приводит к активации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при некоторых видах гемолитических анемий.

3. Соединения, связывающие ионы железа (комплексоны). Надо, правда, оговориться, что в водной фазе некоторые комплексы ионов железа вступают в реакции с супероксидным радикалом и перекисью водорода наряду со свободными ионами железа в растворе.

Вопросы для самоконтроля

1. Мембранные структуры, повреждаемые при действии неблагоприятных факторов. Основные механизмы нарушения барьерных свойств мембран в патологии.

2. Свободные радикалы. Определение и классификация.

3. Происхождение и метаболизм супероксид-радикала.

4. Происхождение и действие на клеточные структуры радикала гидроксила.

5. Основные реакции цепного окисления липидов.

6. Действие процесса перекисного окисления липидов на клеточные структуры (белки и липиды) – перечислить.

 

 

Лекция 6

Вопросы для самоконтроля и зачета

1. Что такое электрический пробой мембраны?

2. Расскажите о приготовлении БЛМ и о том, как была продемонстрирована возможность самопробоя мембраны ионным диффузионным потенциалом

3. Как изучается пробой в липосомах?

4. Как можно изучить явление электрического пробоя в эритроцитах?

5. Изучение электрического пробоя в митохондриях

6. Влияние перекисного окисления липидов и других повреждающих факторов на потенциал пробоя БЛМ.

 

Лекция 7

Резюме (English)

Свободные радикалы - это молекулярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней электронной оболочке и обладающие высокой реакционной способностью. Их изучение ведется методом ЭПР (спиновые ловушки), хемилюминесценции и путем применения ингибиторов реакций, в которых участвуют радикалы определенного типа. Основные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы ненасыщенных жирных кислот, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Радикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и в ходе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, одно время применявшихся в качестве лекарств.

Биохимические методы

Беда в том, что радикалы обладают такой высокой реакционной способностью, что изучать их обычными химическими методами невозможно: стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования совершенно бесполезны. Биохимические анализы позволяют, правда, определять конечные продукты реакций, в которых предполагается участие радикалов, но всегда остается вопрос, а действительно ли радикалы участвовали в процессе и какие именно. Очень важную роль при решении таких вопросов играет так называемый ингибиторный анализ. Классическим примером может служить применение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент, открытый Дж. Мак-Кордом и И.Фридовичем около тридцати лет назад, катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Открытие СОД совершило революцию в умах биохимиков: раз есть фермент, удаляющий свободные радикалы, специально вырабатываемый живыми клетками (и, как выяснилось, чрезвычайно широко распространенный в живой природе), то ясно, что и сами радикалы существуют в природе и почему-то их надо обязательно удалять. До этого мало кто думал, что в метаболизме живых организмов участвуют не только "настоящие" молекулы, но и свободные радикалы. Постепенно СОД стала широко использоваться во всех исследованиях, где изучают роль супероксида в том или ином процессе, будь то индивидуальная биохимическая реакция или развитие болезни у лабораторных животных или человека. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал и остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует. Ингибиторный анализ используется и для изучения реакций с участием других радикалов. Так для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов, на которой мы подробнее остановимся позже, используют жирорастворимые "ловушки" липидных радикалов, которые "ведут" цепи окисления. К числу таких ловушек относятся токоферол (витамин Е) и некоторые синтетические соединения, например трет-бутилгидрокситолуол (ионол). Водорастворимые радикалы эффективно "перехватываются" аскорбиновой или мочевой кислотой. Для "улавливания" радикалов гидроксила (HO·)используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда - этанол. Надо однако сказать, что далеко не всегда ловушки специфичны: многие из них реагируют не только с радикалами, но и с достаточно активными молекулами.

Методы биофизики

"Самый прямой" метод изучения свободных радикалов – метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. К прямым методам изучения радикалов можно отнести также метод хемилюминесценции (ХЛ). При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая в некоторых случаях испускается в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно – их концентрации. Надо отметить, что при всех достоинствах этих методов, в особенности метода ЭПР, их чувствительности оказывается зачастую недостаточной. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов; поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) зачастую так мала, что обнаружить их непосредственно методом ЭПР невозможно. Выход из положения заключается в том, что активные радикалы переводятся в неактивные, стабильные, которые регистрируются с помощью ЭПР [1], стр. 24-28). С этой целью к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками (хотя "ловят" они, конечно не спины, а радикалы). Например, для "улавливания" радикалов гидроксила HO· используют фенилбутилнитрон (ФБН) (см. рис. 1). При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название "спинового аддукта" (от английского слова add – добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки. Поскольку спиновая ловушка "перехватывает" свободные радикалы, она тормозит (ингибирует) тот процесс, который этими радикалами вызывается, например, уменьшает повреждение живых клеток радикалами HO·. Таким образом, спиновые ловушки используются в двух целях: чтобы выяснить, какие радикалы образуются и какие процессы в клетке они вызывают.

Радикалы кислорода

Человеку, как и всякому многоклеточному организму, приходиться бороться с микробами, случайно попавшими внутрь его тела в кровь. Эту борьбу ведут специализированные клетки – фагоциты, к которым относятся гранулоциты и моноциты крови и тканевые клетки – макрофаги. Все эти клетки, соприкасаясь с поверхностью клеток бактерий, начинают энергично выделять свободные радикалы в результате переноса электрона от НАДФН-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембраны фагоцита, на растворенный молекулярный кислород (см. схему на рис. 3).

НАДФН + 2O2 -> НАДФ^+ + 2O2^•- (супероксид анион–радикал)

При этом каждая молекула НАДФН, окисляясь, отдает два электрона в цепь переноса электронов, а каждый из этих электронов присоединяется к молекуле кислорода, в результате чего образуется супероксид – (анион)радикал. Супероксидные радикалы, как мы увидим позже, могут нанести вред как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами (СОД).Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализирует одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Судьба последней может быть разной (см. рис. 2 из лекции №5).

Чтобы увидеть пояснения к рисунку нажмите здесь.

В норме фагоциты используют перекись водорода для синтеза гипохлорита, выделяя специальный фермент - миелопероксидазу (МП). Миелопероксидаза катализирует реакцию:

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате активности ферментов каталазы и глутатион-пероксидазы (GSH-пероксидазы), которые катализируют, соответственно, такие реакции:

В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала (HO·):

H2O2 + Fe^2+ -> Fe^3+ + HO^- + HO·

Эта реакция (известная как реакция Фентона) приводит к печальным последствиям для окружающих клеток. Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, HO· вызывает денатурацию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах HO· разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК; в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Внедряясь в липидный слой клеточных мембран, гидроксильный радикал запускает (инициирует) реакции цепного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и гибели клеток. Таким образом, радикал HO· – это радикал-разрушитель, радикал-убийца. Гидроксильный радикал образуется не только в реакции Фентона. А. Н. Осиповым в нашей лаборатории было показано, что гидроксильные радикалы образуются также при взаимодействии ионов железа (Fe²⁺) с гипохлоритом. При этом радикал гидроксила выделяется даже с более высоким выходом, чем в реакции Фентона.

ClO^- + Fe^2+ + H^+ -> Fe^3+ + Cl^- + HO·

Возвращаясь к реакциям утилизации перекиси водорода, можно сказать, что первая из них – реакция, полезная для организма человека, вторая и третья – защитные, а две последние – безусловно вредны для окружающих клеток и тканей. Супероксидный радикал и продукты его метаболизма (H₂O₂, HO·, ·OO^-, ClO^-) называют активными формами кислорода.

Окись азота

Второй свободный радикал, синтезируемый живыми клетками, – это монооксид азота NO·, часто называемый просто окисью азота. Структурную формулу окиси азота можно записать как ·N=O. NO· образуется клетками стенок кровеносных сосудов (эндотелия); эта реакция катализируется гем-содержащим ферментом NO-синтазой. В присутствии соединений, содержащих SH-группы, из ·NO образуется выделяемый эндотелием "фактор расслабления". Он играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов и кровяного давления: его недостаток приводит к гипертонии, избыток – к гипотонии. Именно с нарушением метаболизма фактора расслабления связывают такие заболевания как эссенциальная гипертензия и другие, связанные с нарушением нормального кровяного давления. ·NO выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с супероксид-радикалами используется для борьбы с микробами (преимущественно грибковой природы). Полагают, что цитотоксическое действие NO· обусловлено его реакцией с супероксидом:

^•N=O + ^•O-O^- + H^+ -> O=N-O-OH (пероксинитрит)

Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием ·OH:

O=N-O-OH -> O=N-O· + HO· (радикал гидроксила)

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток при взаимодействии ·NO с супероксидом. Хорошо, если повреждающее действие системы (·NO + супероксид) направлено на болезнетворные микроорганизмы. Плохо, если оно направлено на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется ·NO (как необходимый регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, в этих местах синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид.

Радикал коэнзима Q

Биологическое окисление субстратов клеточного дыхания, таких как глюкоза, пировиноградная и янтарная кислота и другие, осуществляется, как известно, в два этапа. На первом этапе в цикле трикарбоновых кислот происходит последовательный отрыв атомов водорода от субстрата и образование восстановленных форм пиридиннуклеотидов НАДН и НАДФН. На втором этапе электроны от НАДН и НАДФН переносятся по так называемой дыхательной цепи на кислород. В состав дыхательной цепи входят флавопротеиды, комплексы негемового железа, убихинон и гемопротеиды (цитохромы a,b и c и цитохром-оксидаза). Схема дыхательной цепи дана на рис. 4. Важным звеном цепи переноса электронов служит убихинол (коэнзим Q)(см. рис. 5), радикал которого (семихинон, ·QH) образуется либо при одноэлектронном окислении убихинола (QH₂, гидрохинон-форма) (см. рис. 6), либо при одноэлектронном восстановлении убихинона (Q) (см. рис. 7). В норме радикал этот – не более как рядовой участник процесса переноса электронов; но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других, менее безобидных радикалов, в первую очередь, радикалов кислорода.

Заключение