Методы исследования строения и функций клетки

I. Микроскопические методы

· применяется для исследования строения клетки и её органоидов

· позволяют эффективно исследовать живые, не фиксированные или слегка окрашенные клетки

· главным методическим приёмом является визуальное наблюдение, в том числе их прижизненное (витальное) исследование

· используются объективные методы регистрации клеточного строения: микрофотографирование, цитофотометрию, микроспектрофотометрию, микрокиносъёмку и др.

Виды микроскопии:

1. Световая микроскопия

n осуществляется в лучах видимого спектра

n даёт увеличение около 3000 раз

· люминесцентная (флоуресцентная) микроскопия - препараты освещают сине - фиолетовыми лучами

- применяют спецефические красители флоурохромы

- вызывает свечение (флоуресценцию) многих органических веществ клетки (пигментов, витаминов алкалоидов, дубильных и других высокомолекулярных соединений)

- при исследовании флоуресцирующих препаратов обнаруживают детали и тонкости строения, недоступные обыкновенной микроскопии

· ультрафиолетовая микроскопия - рассматривание препарата в ультрафиолетовых лучах

· и нтерференционная микроскопия

· фазово - конирастная микроскопия

· поляризационная микроскопия, а также их сочетания и модификации

n для большей контрастности и чёткости отдельных клеточных структур применяют прижизненное окрашивание фиксированных препаратов спецефическими красителями (фуксином, метиленовым синим, пиронином, гематоксилином), которые избирательно адсорбируются органоидами, что облегчает их обнаружение и исследование

Электронная микроскопия

n электронный микроскоп изобретён в 30 - х годах XX в., даёт увеличение до 10⁶ раз

n применим только к фиксированным клеткам (фиксатор убивает клетку, но не вызывает грубых изменений структур; под действием фиксатора вещества клетки переходят в нерастворимую форму

n в основе действия лежит просвечивание пучком электронов тончайших, обработанных электронопоглощающими и одновременно фиксирующими соединениями или напылённых парами металлов срезов и фиксация микропрепаратов в сильно увеличенном виде на специальный экран или фотопластинку

n применяется для исследования субмикроскопического строения клеток и органелл

3. Электронная растровая эмиссионная (сканирующая) микроскопия

n даёт возможность получать трёхмерную (обьёмную) картину изображения поверхности срезов и целого объекта

4. Микрохимические (цитохимические) методы

n применение специальных цветных реакций непосредственно в клетке

n служат для определения локализации и количественного содержания отдельных химических веществ

5. Биохимические методы

- дают возможность получения индивидуальных химических соединений и отдельных органелл

· метод дифференциального центрифугирования - различные клеточные органеллы и включения имеют различную плотность, поэтому при очень быстром вращении (до 60 тыс. об \ мин) в специальном приборе - ультрацентрифуге - органеллы тонко измельчённых клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь слоями в соответствии со своей плотностью (более плотные компоненты осаждаются при более низких скоростях центрифугирования). Эти слои разделяют и изучают отдельно

· хроматографическое разделение смесей

· электрофорез

6. Биофизические методы

· метод меченых атомов - замена в молекуле одного из атомов соответствующим радиоактивным изотопом (³ Н, ³² Р, ¹⁴ С) - радиоактивная метка (не отличается по химическим свойствам, зато легко регистрируется счётчиком при перемещениях в результате химических превращений); позволяет установить последовательность этапов, продолжительность во времени, зависимость от условий биохимических процессов, происходящих в живой клетке

· изотопный анализ

· регистрация биоэлектрических потенциалов с помощью электрофизиологической аппаратуры

· хемилюминесценция

· математическое моделирование

- исследуется функционирование мембран, функции органоидов, механизмы возникновения и проведения возбуждения, возникновение мышечного сокращения, биофизические особенности клеток и др

7. Микрохирургические методы

· применяется для генетических, эмбриологических и физиологических исследований, для извлечения частей клетки и их последующего биохимического анализа

· микрооперации производятся с помощью прибора микроманипулятора и при большом увеличении микроскопа (пересадка ядер, хлоропластов, слияние протопластов, пересадка фрагментов зародышевых слоёв зиготы, гибридизация соматических клеток и др.)

8. Метод культуры клеток и тканей

· выращивание выделенных из организма клеток или тканей на искусственных стерильных питательных средах

· культура клеток и тканей - модель для изучения процессов формирования органелл, депонирования запасных органических соединений, роста клеточных оболочек, биосинтеза физиологически активных веществ и т. п.

9. Рентгеноструктурный анализ

· основан на дифракции рентгеновских лучей при прохождении через вещества с упорядоченной структурой (лежит в основе расшифровки структуры ДНК, гемоглобина, миоглобина, коллагена и др. биологических веществ