Кількісне визначення сечової кислоти в сечі

Мета: Опанувати титриметричний метод визначення сечової кислоти в сечі та зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 73).

Принцип методу: Метод ґрунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфорно-вольфрамовий реактив, внаслідок чого утворюються оксиди вольфраму нижчої валентності синього кольору, інтенсивність забарв­лення яких пропорційна вмісту сечової кислоти й визначається шляхом титрування червоною кров'яною сіллю. Ця сіль окиснює оксиди вольфраму й синій колір розчину зникає.

Матеріали та реактиви:

1. Фосфорно-вольфрамовий реактив: до 100 г натрій вольфрамату додають 80 мл розчину з масовою часткою ортофосфатної кислоти 85 %, 900 мл води, кип'ятять протягом 2 годин у колбі зі зворотним холодильником і після охолодження доводять об'єм до 1 л.

2. Розчин калій гексоціаноферату (ІІІ) (К₃[Fe(CN)₆]): до 3,292 г К₃[Fe(CN)₆] додають 2 г калій гідроксиду (КОН) і розчиняють у 1 л води.

3. Стандартний розчин сечової кислоти – 0,5 мг у 1 мл: до 0,5 г висушеної сечової кислоти додають 0,5 г літій карбонату (Li₂CO₃), 25 мл води, нагрівають при температурі 50 – 60 ^оС до розчинення, охолоджують і розводять водою до об'єму 1 л.

4. Розчин з масовою часткою натрій карбонату (Na₂CO₃) 20 %.

5. Досліджувана сеча.

 

Хід визначення

До 1,5 мл сечі додають 1 мл фосфорно-вольфрамового реактиву, 1 мл розчину натрій карбонату, перемішують і титрують розчином К₃[Fe(CN)₆] до зникнення синього забарвлення.

Для визначення вмісту сечової кислоти в сечі необхідно знати, яка кількість її відповідає 1 мл К₃[Fe(CN)₆]. Наприклад, на титрування стандартної проби, яка містить 0,25 мг сечової кислоти у 0,5 мл, витрачено 0,34 мл К₃[Fe(CN)₆]. У цьому випадку 1 мл реактиву відповідає 0,73 мг сечової кислоти (0,25: 0,34).

Масу сечової кислоти в сечі за добу (m) вираховують за формулою:

(мг),

де n – кількість сечової кислоти, яка відповідає 1 мл калій гексоціаноферату (ІІІ) (мг/мл); N – об'єм К₃[Fe(CN)₆], який витрачено на титрування проби (мл); д – об'єм сечі за добу (мл); V – об'єм сечі, взятої для аналізу (мл).

У нормі концентрація сечової кислоти у добовій кількості сечі складає 1,6 – 4,8 ммоль/доб (270 – 600 мг).

Клініко-діагностичне значення

Дослідження вмісту сечової кислоти

У біологічних рідинах

Значення сечової кислоти у патології зв'язано з низькою її розчинністю. При концентраціях, перевищуючих нормальні значення для біологічних рідин, сечова кислота осаджується у вигляді кристалів натрієвої солі (скупчення цих кристалів називають тофусами). У патології вмісту сечової кислоти в крові виділяють такі стани:

гіперурікемія – підвищення вмісту сечової кислоти в крові (в сечі вміст сечової кислоти при цьому може бути у нормі);

гіпоурікемія – зниження вмісту сечової кислоти в крові.

Гіперурікемія виникає або при підвищеному утворенні сечової кислоти, або при зменшенні її виведення з орга­нізму (табл. 12). Гіперурікемія супроводжує всі форми ниркової недостатності, але для характеристики ниркової патології досліджують сечову кислоту тільки тоді, коли визначення сечовини і креатиніну дає суперечливі результати.

Підвищується вміст сечової кислоти в крові при по­даг­рі, гострому та хронічному нефриті, лейкозах, мієломній хворобі, гемолітичній жовтяниці, інфаркті міокарду, діабеті, голодуванні, псоріазі, отруєнні свинцем, від приймання сечогінних ліків.

 

Таблиця 12

Причини гіперурікемії

Підвищене утворення сечової кислоти	Зниження ниркової екскреції сечової кислоти
Збільшення синтезу пуринів	Хронічна ниркова недостатність
Надлишкове надходження пуринів з їжею	Підвищена ниркова реабсорбція (зниження секреції): саліцилати (низькі дози); органічні кислоти (наприклад, молочна кислота) та внаслідок прийому алкоголю
Порушення метаболізму АТФ: алкоголь, гіпоксія тканин
Підвищений оборот нуклеїнових кислот: злоякісні новоутворення, псоріаз, цитотоксичні препарати

 

Гіпоурікемія зустрічається дуже рідко і не має клінічних наслідків. Знижується вміст сечової кислоти у крові після прийому піперазину, атофану, антикоагулянтів, інсуліну та ін.

Контрольні питання до розділу 4

1. Охарактеризуйте обмін небілкових нітрогенвмісних компонентів крові в нормі та патології (сечовини, амоніаку, сечової кислоти, креатину і креатиніну).

2. Охарактеризуйте поняття «залишковий Нітроген», «резидуальний Нітроген», «urea ratio», «кліренс креатиніну».

3. Чим відрізняються уніфікований діацетилмоноок-симний метод визначення сечовини в біологічних рідинах та ферментативний?

4. «Уреатест» визначення сечовини.

5. Клініко – діагностичне значення визначення креатиніну, креатину, сечовини, сечової кислоти в біологічних рідинах.

6. Діагностичне значення проби Реберга.

7. Які методи аналізу використовують для визначення речовин фракції небілкових нітрогенвмісних компонентів?

8. Вкажіть речовини, які мають найбільшу діагностичну значимість серед фракції небілкових нітрогенвмісних компонентів крові та біологічні матеріали, в яких їх слід визначати.

Розділ 5. ФЕРМЕНТИ

 

Ферменти (ензими) – сполуки білкової природи, що мають специфічні властивості каталізуватирізноманітні перетворення речовин у живому організмі. За хімічною будовою розрізняють прості та складні ферменти. Всі фер­менти характеризуються специфічністю дії, тобто каталізують тільки чітко визначений тип хімічної реакції. Більшість ферментів виявляють максимальну активність в інтервалі температур від 20 до 37 ⁰С. Збільшення температур призводить до зниження активності ферментів, а велике збільшення – до інактивації та денатурації. Активність ферментів залежить також від рН середовища і наявності в реакційній суміші активаторів та інгібіторів реакції. Опти­мальне значення рН для дії більшості ферментів складає 6,0 – 8,0. Винятком є шлунковий фермент пепсин, який активний при рН менше 2. Активаторами ферментів є йони металів, органічні кислоти, самі ферменти (аутоактивація). Інгібуючу дію виявляють концентровані мінеральні кислоти, солі важких металів.

Активність ферменту прийнято виражати кількістю перетвореного їм субстрату в перерахунку на 1 літр біологічного матеріалу за визначену одиницю часу. В якості міжнародної одиниці прийнята активність ферменту (Е), яка виражена в мкмоль/хвил. У перерахунку на 1 літр біомате­ріалу: Е/л = мкмоль/(хвил. · л).

У міжнародній системі одиниць СІ за одиницю активності ферменту прийнятий Катал (кат):

кат/л = моль/(сек. · л).

Виділяють шість основних класів ферментів:

1. Оксидоредуктази – каталізують окисно-відновні процеси.

2. Трансферази – прискорюють реакції перенесення окремих атомів і груп атомів від одних субстратів до інших.

3. Гідролази – каталізують гідролітичні реакції.

4. Ліази – каталізують процеси відщеплення груп негідролітичним шляхом з утворенням подвійного зв'язку або, навпаки, приєднання відповідних груп атомів за місцем подвійного зв'язку.

5. Ізомерази – прискорюють процеси ізомеризації органічних сполук.

6. Лігази (синтетази) – каталізують реакції синтезу, які пов'язані з використанням енергії АТФ та деяких інших трифосфатів.

Основним біологічним матеріалом для дослідження активності ферментів є сироватка крові.

Визначення активності α-амілази в біоматеріалі

 

α-Амілаза – фермент, що здійснює гідролітичнероз­щеплення полісахаридів (крохмалю, глікогену й інших продуктів, що містять три та більше залишків глюкози) до декстринів і мальтози. Процес розпаду полісахаридів – стадійний:

крохмаль → еритродекстрини → ахродекстрини →

мальтотетроза → мальтоза → глюкоза.

Кінцевий продукт дії амілази (глюкоза) не дає кольорової реакції з йодом.

Найбільш багаті на амілазу підшлункова та слинні залози. Амілаза секретується в кров головним чином із цих органів. Плазма крові людини містить амілази двох ізозимних типів: панкреатичну (р-тип), яка секретується під­шлунковою залозою, і слинну (S-тип), яка секретується слинними залозами. Вважають, що в здорових людей у сироватку крові входять дві ізоамілази р-типу і три – S-типу. У кожному з цих типів амілаз є декілька ізоформ. Ізоамілази слини поділяють на два сімейства (у залежності від їхньої молекулярної маси й електрофоретичноїрухливості). З сечею виділяється в основному р-амілаза, що є однією з причин більшої інформативності про функціональний стан підшлункової залози. Вважають, що 65 % амілазної активності сечі обумовлено панкреатичною амілазою, у той час як 60 % амілолітичної активності сироватки забезпечується амілазою слинних залоз. При гострому панкреатиті вона збільшується в сироватці до 89 % і в сечі до 92 % без зміни показників амілаз слинних залоз. У здорових людей вміст слинної та панкреатичної амілази в крові приблизно однаковий, у сечі ж вміст панкреатичної амілази в 2 рази більший, ніж амілази слинних залоз.

Амілолітичну активність мають кишечник, печінка, нирки, легені, тонка кишка, жирова тканина. Проте далеко не всі з перерахованих органів є продуцентами амілази. Фермент пов'язаний як із білками плазми крові, так і з фор­меними її елементами. Можливо, це є формою депонування і транспорту ферменту.

Методи вивчення активності α-амілази в біологічних рідинах (сироватці, сечі, поті) поділяються на дві основні групи:

1. Сахарифікуючі – базуються на дослідженні сахарів, що утворюються з крохмалю (глюкози і мальтози).

2. Амілокластичні – базуються на визначенні залишку нерозщепленого крохмалю за ступенем інтенсивності його забарвлення з йодом. Молекули декстринів, що мають 30 гексознихзалишків, дають з йодом синє забарвлення розчину; молекули з 8 – 2 залишків – червоне; молекули з вхідними 4 – 5 гексозними залишками не забарвлюють реактив.

Амілокластичні методи більше специфічні і чутливі, ніж сахарифікуючі.

Лабораторна робота № 10

Визначення активності α–амілази зі стійким