Тест-реакция – определение понятия

 

Использование любого из возможных тест-объектов в биосенсорном устройстве предполагает применение физико-химического преобразователя сигнала, тип которого определяется особенностью реакций и превращений в тест-объекте, и невозможно найти какой-либо один, универсальный преобразователь на все случаи анализа, т. е. следить за процессами взаимодействия анализируемого вещества и тест-объекта в каждом конкретном случае необходимо индивидуальным способом. И анализировать сам процесс взаимодействия необходимо так, чтобы, во-первых, получить как можно более полную информацию об этом процессе (что, в свою очередь, дает возможность использовать в аналитической системе более полно все основные преимущества тест-объекта); во-вторых, осуществлять анализ не «на глазок», а с помощью специальных инструментов, дающих возможность оценить результаты в виде объективной информации в форме измеряемой физической величины (напряжение, ток и т. д.).

Введем понятие «тест-реакция» («тест-процесс») – процесс или реакция, которые позволяют качественно или количественно оценивать процесс взаимодействия тест-объекта с анализируемым веществом (или оценивать состояние тест-обекта после воздействия анализируемой пробы).

Следует отметить, что приведенное определение – лишь обобщенная характеристика тест-реакции для «обобщенного» тест-объекта. В каждом же конкретном случае подразумеваются вполне определенные процессы и превращения. Например, используя описание биосенсора Лайона и Кларка (см. раздел 1.1), тест-реакцией следует считать процесс уменьшения содержания кислорода. При этом содержание кислорода в примембранном пространстве датчика должно быть обратно пропорционально концентрации глюкозы в анализируемой пробе. Для аспарагиновых ферментных электродов, описанных в разделе 2.6, тест-реакция – образование аммиака.

Не следует отождествлять понятия «тест-реакция» и «способ регистрации тест-реакции». Так, процесс образования аммиака можно регистрировать совершенно различными способами: с помощью ионосективного электрода, с помощью газового мембранного электрода, колориметрически и т. д. Следовательно, одна и та же реакция может быть зарегистрирована совершенно различными способами.

В то же время для одного и того же тест-объекта, для одного и того же определяемого вещества (т. е. одной и той же тест-системы) могут быть выбраны совершенно различные тест-реакции. В качестве примера воспользуемся приведенной ранее схемой окисления глюкозы кислородом в присутствии ГОД:

ГОД

глюкоза + О₂ глюконовая кислота + Н₂О₂.

 

В качестве тест-реакции может быть использован как процесс потребления исходного реагента – кислорода (как это реализовано в электроде Лайона и Кларка), так и процессы образования любого из продуктов реакции – глюконовой кислоты или перекиси водорода. Причем последним процессам в некоторых случаях отдается предпочтение, более того, биосенсорные устройства, использующие указанные тест-реакции, были созданы.

Кроме упомянутых выше процессов изменения содержания химических компонентов, в качестве тест-реакции в указанной аналитической системе может быть использован процесс выделения тепла при окислении глюкозы (около 100 кДж/моль), т. е. в последнем случае тест-реакция – не химический, а физико-химический процесс, и для его оценки должен использоваться физический параметр.

Применение в качестве тест-объектов более сложных, чем ферменты или другие биомолекулы, систем (органелл, микроорганизмов, тканей, органов и т. д.) дает еще более широкий выбор тест-реакции для реализации биосенсорного устройства. Однако при всем богатстве выбора в каждом конкретном случае необходим дифференцированный подход к выделению именно данного, а не иного процесса в ранг тест-реакции. Этот процесс должен удовлетворять вполне определенным требованиям, главными из которых являются следующие:

1. Процесс должен надежно регистрироваться с помощью физико-химического датчика.

2. Процесс должен обеспечивать однозначную регистрацию количественных и качественных характеристик взаимодействия определяемого агента и тест-объекта.

3. Среди прочих процессов выбирается тот, который позволяет реализовать наиболее точный метод его регистрации.

4. Регистрация процесса взаимодействия тест-объекта и определяемого агента должна быть реализована с помощью как можно более простого и надежного датчика.

5. Измеряемый параметр регистрируется наиболее дешевым датчиком.

6. Регистрация тест-реакции должна удовлетворять ряду специальных требований, определяемых конкретными условиями использования биосенсора.

Следует отметить, что идеальных тест-реакций нет, поэтому не удивительно, что существует значительное разнообразие в конструкциях биосенсорных устройств, созданных на основе одной и той же тест-системы.

Перечисленные требования отнюдь не исчерпывают весь список ограничений при подборе тест-реакции, это лишь главные требования. Но и среди перечисленных основными считаются те, которые относятся к определению датчика, регистрирующего эту реакцию. При этом следует знать, что возможностей подбора датчика гораздо больше, чем тест-реакций. Тем не менее при создании биосенсорных устройств в подборе метода регистрации и, следовательно, физико-химических датчиков существует определенный консерватизм. Наибольшее распространение получили электрохимические и оптические датчики. Поэтому в дальнейшем уделим особое внимание именно указанным типам преобразователей сигнала тест-объекта.

 

 

Электрохимические датчики

Регистрации тест-реакции

 

Электрохимические датчики регистрации тест-реакции являются, пожалуй, наиболее распространенными приборами, применяемыми в конструкциях биосенсоров. Это связанно, с одной стороны, с тем, что указанные датчики просты и удобны в эксплуатации, а отводимые от них сигналы могут напрямую (без предварительного преобразования) подаваться в систему регистрации (включая иЭВМ); с другой стороны, датчики такого рода – весьма распространенные в лабораторной и аналитической практике устройства. Их разработка проводится уже на протяжении почти 100 лет.

Все известные конструкции электрохимических датчиков подразделяются по регистрируемым электрическим параметрам на потенциометрические, амперометрические, кулонометрические и кондуктометрические измерительные устройства. В целом различные типы электрохимических датчиков пригодны для определения содержания широкого круга химических соединений в жидкой и газообразной средах.

 

3.2.1.. Основные электрохимические понятия

и определения

Любая окислительно-восстановительная реакция может протекать по химическому или электрохимическому механизмам. В первом случае для обмена электронами между окислителем (Ох) и восстановителем (Red) необходим непосредственный контакт. Во втором варианте окислитель и восстановитель пространственно разделены, а реакции протекают на границе раздела фаз электрод-электролит, при этом основная часть химической энергии преобразуется в электрическую. На ход электрохимического процесса влияют такие факторы, как строение границы раздела фаз электрод-электролит (раствор, расплав, твердый электролит), условия подачи в межфазную область реагентов и вывода продуктов реакции.

Основной стадией электрохимического процесса является обмен электронами, ионами, а также электронными вакансиями (дырками) между электродом и раствором. Эта стадия получила название реакции переноса заряда. Некоторые особенности стадии переноса электронов можно проиллюстрировать на примере электрохимических реакций, протекающих на металлическом электроде (рис. 10), рассматривая проводник первого рода с точки зрения зонной теории твердого тела. Как следует из схемы I на рис. 10, при данном расположении вакантной орбитали вещества Ох и заполненной орбитали реагента Red по отношению к энегетическому уровню Ферми (Y _F) обмен электронами между Ох или Red и металлом невозможен. Однако при сдвиге потенциала электрода в отрицательную область Y _F увеличивается и при определенном напряжении может быть сравним или начинает превышать энергию вакантного уровня окисленной компоненты (схема II). В этом случае может произойти перенос электронов из заполненных уровней зоны проводимости металла на вакантную орбиталь Ох – происходит восстановительный процесс, сопряженный с катод ным

 

 

	YF

e ^-

		– Ox

I

Y _F

 

II

		–Ox

 

металл раствор e ^-

 

 

III

 

Рис. 10. Перенос электрона на границе раздела металл-раствор. Заштрихованная часть – доля зоны проводимости металла, заполненная электронами

током (I_c). При сдвиге же потенциала электрода в положитель ную область уровень Ферми понижается и электроны с заполненной орбитали восстановленной формы Red переносятся на вакантные энергетические уровни металла. Этот процесс является окислительным, а ток – анодным (I_а).

Критический потенциал (потенциал нулевого тока) металлического электрода тесно связан со стандартным потенциалом (Y ^о)окислительно-восстановительной пары Ох/Red. Так, редокс-пара, характеризующаяся более положительным Y ^о,будет генерировать I _а при более положительных потенциалах электрода, чем пара, Y ^окоторой отрицательнее.

Проанализируем простую окислительно-восстановительную реакцию:

 

Ох + ne^- Red,

 

где n – общее число электронов, участвующих в редокc-процессе. С термодинамической точки зрения, для равновесия в объеме раствора справедливо следующее соотношение между химическими потенциалами (m_i) всех компонентов реакции:

 

m_ox^b + nm_e^b = m_red^b. (8)

 

индексы b относятся к фазе раствора. Уравнение (8) можно представить в расширенной форме:

 

m⁰_ox^b + RT lna_ox^b + n(m⁰_e^b + RT lna_e^b) = m⁰_red^b + RT lna_red^b, (9)

 

где m⁰_i ^b и a_i^b – стандартные химические потенциалы и активности компонентов окислительно-восстановительных реакций.

Так как внутренний электрический потенциал связан с химическим потенциалом, т. е. совершаемую электрическую работу при переносе элементарного заряда нельзя отделить от химической составляющей, то становится понятной невозможность определения его абсолютного значения, а также абсолютного значения гальвани-потен-циала. Экспериментально возможно измерить только изменения величины разности внутренних и гальвани-потенциалов. В подобных случаях определяется электродвижущая сила Y гальванического элемента, представляющего собой погруженные в исследуемый раствор индикаторный (рабочий) электрод и электрод сравнения.

Равновесие между компонентами реакции зависит как от активностей окислителя и восстановителя, так и от разности электрических потенциалов на электроде. Условия равновесия определяются уравнением Нернста:

 

Y = Y ^о + (RT/ nF) ln(a_ox^b/a_red), (10)

 

где Y ^о – стандартный потенциал окислительно-восстановительной реакции; F – постоянная Фарадея. При погружении металлического электрода (электрод первого рода) в раствор соли этого металла на его поверхности происходят окислительно-восстановительные процессы, в результате чего между раствором и металлом возникает разность электрических потенциалов. Однако такое равновесие неустойчиво, и даже крайне малые токи, протекающие в цепи, могут его нарушить, что в свою очередь приведет к изменению разности электрических потенциалов. При разработке электрохимических датчиков зачастую используют неполяризующиеся электроды, которые характеризуются большим током обмена, т. е. потенциал которых практически не смещается при пропускании тока. На основе таких электрохимических систем изготавливаются электроды сравнения. В практике используются главным образом три типа электродов сравнения: 1) водородный; 2) каломельный; 3) хлорсеребряный. Причем первый применяется крайне редко, в основном для определения потенциалов остальных, поскольку потенциал одно нормального водородного электрода принят за нуль.

Электрохимическую цепь каломельного электрода можно представить следующим образом:

 

Pt | Hg | Hg₂Cl₂ | KCl ~ исследуемый раствор.

 

На поверхности жидкой ртути находится слой каломели (труднорастворимой соли ртути), пропитанный раствором хлорида калия. Поскольку концентрация ионов Hg⁺ на границе металл-раствор близка к насыщению и постоянна, то определять разность электрических потенциалов в такой системе будут лишь ионы Cl ^-:

 

Е = Е⁰ + (RT/ F) ln a _Cl. (11)

 

На практике используются три типа каломельных электродов сравнения: децимолярный (заполненный 0,1 М раствором КCl), нормальный (1 М КCl) и насыщенный (насыщенный раствор КCl).

Аналогично каломельному электроду сравнения цепь хлорсеребряного электрода сравнения представляется:

 

Ag | AgCl | KCl ~ исследуемый раствор.

 

Хлорсеребряный электрод обладает постоянным и хорошо воспроизводимым потенциалом. Его можно использовать в широком интервале температур (0 – 95°С).

Каломельный и хлорсеребряный электроды используются в качестве электродов сравнения (индеферентных электродов) при работе с потенциометрическими и амперометрическими датчиками. В этом случае электрод сравнения представляет собой изолированную ячейку (обычно стеклянный сосуд), заполненную раствором хлорида калия нужной концентрации. В растворе КCl находится соответствующий (каломельный или хлорсеребряный) неполяризующийся электрод. Внутриэлектродный раствор контактирует с анализируемым через солевой мостик.

Хлорсеребряные электроды (реже каломельные) используются также для отведения потенциала от внутриэлектродной поверхности ионоселективной мембраны потенциометрических датчиков. В этом случае ионоселективные электроды заполняются растворами, содержащими ионы Cl^- (для стабилизации потенциала хлорсеребряного электрода).

 

Ионоселективные электроды

Ионоселективные электроды – это устройства, генерирующие потенциал (потенциометрические датчики), величина которого пропорциональна логарифму активности ионов:

 

DY ~ (RT/zF) ln a’, (12)

 

где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; z – заряд иона; F — число Фарадея; a’ – активность иона в растворе.

Конструкции ионоселективных электродов могут быть различных типов в зависимости от мембраны. Различают электроды с твердой и жидкой мембранами. В электродах с твердой мембраной в качестве ионочувствительного элемента используется тонкий слой монокристалла или смеси кристаллов, а также стекла, которые обладают ионной проводимостью. Если мембрана изготовлена на основе смешанных кристаллов или монокристаллов, принято считать, что электрод является гомогенным. В мембранах гетерогенных электродов кристаллический осадок диспергируется в инертном носителе, в качестве которого наиболее часто применяется силиконовая резина или поливинилхлорид (ПВХ). Основой ионоселективных электродов с жидкой мембраной являются ионообменник или нейтральный переносчик ионов, которые растворяются в не смешивающихся с водой растворителях. Тонкие пористые мембраны из неорганических или органических материалов пропитываются этими растворами и переносчики ионов внедряются в полимерную матрицу (например, ПВХ), в которую дополнительно введены пластификаторы: дибутилфталат, диоктилфталат или диоктиладипинат.

Рассмотрим принцип действия ионоселективного электрода на примере датчика для определения содержания ионов калия на основе жидкой мембраны, содержащей антибиотик валиномицин. Этот антибиотик представляет собой циклический пептид. Причем структура его молекулы такова, что неполярные фрагменты молекул аминокислот находятся снаружи цикла, а полярные – внутри. Такое расположение компонентов молекулы придает высокую степень гидрофобности валиномицину. С другой стороны, внутри цикла может располагаться ион К⁺, удерживаемый координационными связями. Комплекс валиномицин-калий также гидрофобен. Если валиномицин ввести в состав мембраны из пластифицированного поливинилхлорида, то такая мембрана станет проницаемой для ионов калия.

 

Ag/AgCl

 

К⁺-электрод электрод сравнения

 

 

KCl