Организмов, тканей, клеток или клеточных компонентов в биосенсорном устройстве

 

Новым словом в разработке биосенсоров является создание датчиков путем использования целых клеток микроорганизмов или тканей. При этом отмечаются следующие их достоинства:

1. Нет необходимости получать очищенные ферменты или другие компоненты клеток, можно непосредственно использовать целые клетки или срезы тканей без выделения и очистки белков. Это в конечном итоге приводит к значительному снижению стоимости.

2. Ферменты и другие биомолекулы находятся в их естественном окружении.

3. Активность ферментов стабилизирована.

4. Биосенсор можно регенерировать погружением в питательную среду. Микроорганизмы сохраняют жизнеспособность довольно долго.

5. Целые клетки могут содержать несколько кофакторов и ферментов, катализирующих реакции, которые трудно, если вообще возможно, осуществить с помощью одного иммобилизованного фермента. Кроме того, кофакторы, необходимые для ферментативных реакций, находятся в естественно иммобилизованном состоянии.

Однако у таких биосенсоров есть и недостатки, среди которых обычно отмечают:

1. Низкую селективность, обусловленную присутствием в клетке

 

микроорганизма ряда ферментов, которые могут катализировать побочные реакции.

2. Часто наблюдаемый медленный отклик биосенсора, поскольку в диффузионные барьеры в данном случае включается и плазматическая мембрана.

В качестве примеров можно привести использование клеток Neurospora europea для определения аммиака, Тrichosроron brassicae для определения уксусной кислоты, Sarcina flava (глутаминаза) для определения глутамина, Аzotobacter vinilandii (нитратредуктаза) для определения нитрат-ионов и срезов почек свиньи для определения глутамина. Этот список может быть многократно увеличен, поскольку многие организмы (как одноклеточные, так и многоклеточные) являются источником тех или иных биополимеров, пригодных к использованию в качестве биологических тестирующих элементов биосенсоров. Следует отметить, что замена биомолекул клетками зачастую не приводит к существенному изменению конструкции биосенсора. Во всяком случае, электрод для определения содержания глюкозы на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas fluorescens отличается от описанного в разделе 1.1 ферментного электрода Лайона и Кларка лишь тем, что на поверхность электрода Кларка нанесены иммобилизованные бактерии, а не фермент в очищенном виде. Да и по эксплуатационным параметрам упомянутые электроды различаются мало.

При включении клеток или высечек тканей в состав биосенсорного устройства нельзя преодолеть определенный концентрационный предел содержания определяющих работоспособность датчика биологических компонентов. Их предельная концентрация вблизи физико-химического датчика не может превышать внутриклеточную концентрацию. Следует отметить, что указанные компоненты распределены в клетке неравномерно. Например, в митохондриях концентрация оксидаз или глутаминазы выше, чем в клетке, т. е. отдельные органеллы (в особенности такие автономные, как митохондрии или хлоропласты) вполне пригодны для использования в качестве тест-объектов биосенсорных устройств. В табл. 3. даны сравнительные характеристики электродов для определения содержания глутамина на основе фермента, митохондрий, бактерий и высечки ткани (печень свиньи), приведенные в работе Арнольда и Решнитца (1987).

Сравнительные характеристики глутаминовых биосенсоров

 

Параметр	Фермент	Митохондрии	Бактерии	Ткань
Ответ (мВ/декада)	33¸41
Предел обнаружения (моль/л)	6,0×10^-5	2,2×10^-5	5,6×10^-5	2,0×10^-5
Область линейной зависимости (х10^-3 моль/л)	0,15 ¸ 3,3	0,11 ¸ 5,5	0,1 ¸ 10	0,064 ¸ 5,2
Быстродействие (мин)	4 – 5	6 – 7		5 – 7
Продолжительность работоспособности электрода (дни)

 

Все биосенсоры, упоминаемые в табл. 3, работали однотипно. Гидролиз глутамина катализировался либо очищенной иммобилизованной глутаминазой, либо этим же ферментом, содержащимся внутри митохондрий или клеток бактерий и ткани:

 

глутаминаза

глутамин + Н₂О глутамат + NH₃.

 

Содержание образующегося аммиака определялось с помощью аммонийного ионоселективного электрода.

Как следует из анализа результатов табл. 3, во многих случаях применение в качестве тест-объектов клеток и клеточных органелл предпочтительнее. Из приведенных в табл. 3 параметров биосенсоров только по быстродействию (и то незначительно) ферментные электроды превосходили остальные, по остальным же характеристикам они заметно уступали.

Кроме того, при использовании целых клеток или даже организмов (как будет показано далее) заметно увеличиваются возможности выбора тест-реакции, а следовательно, и подбора метода ее регистрации.

 

 

Методы иммобилизации

Тест-объектов

 

При изготовлении биосенсорных устройств биологические тестирующие компоненты иммобилизуются. Процесс иммобилизации, с одной стороны, позволяет избежать потери (растворение и диспергирование в среде) биологических тестирующих компонентов, с другой – дает возможность располагать эти элементы как можно ближе к физико-химическому датчику без дополнительных промежуточных приспособлений. Одновременно с указанными задачами при иммобилизации решается и ряд других: стабилизация активности биологического тестирующего элемента, пространственное разделение отдельных молекул, предохранение от биологического повреждения и т. д. Например, расщепление ферментов микроорганизмами эффективно подавляется при включении их в нерастворимые носители, в которых диффузия продуктов биосинтеза микроорганизмов замедлена. Ковалентная пришивка биокатализаторов предотвращает агрегацию ферментов, автолиз и разложение под действием примесей протеолитических ферментов. Для предотвращения инактивации глюкозооксидазы фермент иммобилизован на активированном углероде, в котором происходит быстрое разложение перекиси водорода, способной ингибировать фермент. Методики иммобилизации ферментов, антител (антигенов), клеток, клеточных органелл и других биологических компонентов во многом схожи.

Иммобилизованные биологические тестирующие элементы, т. е. элементы, связанные с нерастворимыми в воде или с высокомолекулярными водорастворимыми полимерами, являются главной составной частью аналитических приборов. В зависимости от их каталитической способности и механических свойств могут быть сконструированы аналитические приборы на основе мини-реакторов, электродов, термисторов или других биосенсорных устройств. Представляется целесообразным из всех известных методов иммобилизации проанализировать только те, которые используются в аналитической химии: иммобилизация путем адсорбции на носителях; включение в пространственную сетку гелей; иммобилизация путем сшивания бифункциональными реагентами; ковалентная сшивка с носителем; иммобилизация микрокапсулированием.

Иммобилизация путем адсорбции на носителях. Этот метод давно известен и наиболее прост. Сущность его заключается в инкубировании раствора белка или суспензии клеток в водной взвеси носителя с последующим отмыванием неадсорбированных элементов. В качестве носителей используется самый широкий набор веществ органической и неорганической природы. Основным недостатком адсорбционной иммобилизации является слабая фиксация тест-объекта на носителях. Изменение рН, ионной силы раствора, температуры может привести к десорбции. Если десорбция обратима, иммобилизованный препарат можно регенерировать.

Увеличения сорбционной способности можно добиться, например, предварительной обработкой носителей гидрофобными соединениями с последующей адсорбцией тест-объекта или обработкой растворами солей металлов переходных групп (титана, хрома, олова и алюминия). Для этой цели применяются соли, растворенные в водных растворах или в неводных средах. Такая предварительная обработка носителей увеличивает их сорбционную способность более чем в 40 раз, кроме того, значительно повышается удельная активность иммобилизованных препаратов. Метод используется для иммобилизации тест-объектов на неорганических и органических носителях, трубках и волокнах, в результате чего биологические элементы приобретают устойчивость в растворах высокой ионной силы. Механизм фиксации тест-объекта на носителях, активированных ионами металлов, сложен. В адсорбции белка существенную роль играют водородные связи, электростатическое взаимодействие, и особенно координационные связи.

Включение в пространственную сетку гелей. Преимуществом этого метода является то, что при включении в гель не происходит химической модификации глобул белка, исключается денатурация фермента или антитела, иммобилизация протекает в мягких условиях, что особенно важно при иммобилизации живых клеток или нативных клеточных органелл.

Используются различные синтетические органические (полиакриламидный, полиэтиленгликольметакрилатный, поливиниловый спирт и др.) и полисахаридные (агаровый, альгинатный, хитозановый и т. п.) гели, а также различные неорганические гели. Метод относительно прост и нетрудоемок.

Относительно часто тест-объекты иммобилизуются включением в полиакриламидный гель, который образуется при реакции акриламида с N,N’-метилен-бис-акриламидом (сшивающим агентом). Поскольку полимеризация протекает по радикальному механизму, в качестве инициаторов реакции применяются системы, генерирующие свободные радикалы. Для этой цели используется, например, окислительно-восстановительная система персульфата аммония и N,N,N’,N’-тетра-метилэтилендиамина (ТМЭД). Все компоненты (мономеры и особенно инициаторы полимеризации) токсичны. Поэтому при включении живых клеток в полиакриламидный гель применяется также фотохимический способ генерации радикалов с использованием рибофлавина. Для дальнейшего снижения токсичности компонентов реакционной смеси полимеризацию проводят при низких температурах (минус 20– 0 ^оС). Кислород служит ингибитором полимеризации. Присутствие в полимеризационном растворе сшивающего агента способствует образованию поперечных связей между растущими полиакриламидными цепями, в результате чего гель приобретает структуру трехмерной сетки, ячейки которой захватывают клетки или молекулы белка.

Механические свойства геля (прочность, эластичность, вязкость) влияют на активность тест-объекта и зависят от степени полимеризации и качества сшивки, которую можно регулировать, варьируя соотношение акриламида и бис-акриламида. В водной среде полиакриламидный гель набухает. Интенсивность набухания зависит от концентрации геля и весового соотношения мономера и сшивающего агента. Высушенные гели при повторном набухании не релаксируют в исходное состояние. По химической природе полиакриламидный гель слабогидрофобен и довольно инертен. Скорость диффузии низкомолекулярных веществ в неконцентрированных гелях почти такая же, как в воде (ниже 15 %). При иммобилизации фермента в полиакриламидном геле выход может достигать 100 %. В случае сложных субъединичных ферментов при иммобилизации сохраняется до 66–18 % исходной активности. Распространенные способы иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле обладают недостатками, обусловленными тем, что частицы биокатализатора, полученные после измельчения, неоднородны по форме и размерам. В последнее время разработаны методы получения сферических частиц, обладающих микронным диаметром, путем полимеризации в мицеллах.

Полиэтиленгликольметакрилатный гель образуется при сополимеризации метакрилатэтиленгликоля (МЭГ) и диметакрилат этиленгликоля, который является сшивающим агентом. Инициатором полимеризации является система, генерирующая радикалы и включающая персульфат аммония и ТМЭД или персульфат калия, рибофлавин и свет. Полиэтиленгликольметакрилатные гели сходны с полиакриламидными, но обладают улучшенными механическими свойствами и прозрачностью. Для увеличения пластичности в них добавляется до 2,5 % от МЭГ акриламида.

Широкое распространение получили методы иммобилизации ферментов в пространственно сшитые другие полимерные гели, образующиеся при облучении их g-лучами. В качестве мономеров используются акриламид, N-винилпиралидон, поливиниловый спирт и другие полимеры. Полученные гели обладают высокой каталитической активностью и хорошей механической прочностью.

Полисахаридные и полиионитные гели отличаются тем, что их пространственная структура образуется не за счет ковалентных, а именно водородных и ионных связей. Образование указанных гелей протекает в исключительно мягких условиях, поэтому тест-объекты слабо повреждаются. Стабилизация агарового геля происходит при охлаждении смеси биологических тестирующих элементов с «расплавленным» раствором агар-агара. Гели альгината сшиваются поливалентными катионами (Са²⁺, Ва^{2 +} и др).

Иммобилизация путем сшивания бифункциональными реагентами. Этим способом получаются, например, мембраны, используемые в ферментных электродах. При добавлении же в раствор фермента реагента, обладающего двумя или большим числом реакционноспособных групп, глобулы белка сшиваются с образованием пространственной сетки. Иммобилизация ферментов путем сшивания бифункциональными реагентами осуществляется четырьмя способами: 1) непосредственным сшиванием белков (тест-объектов); 2) сшиванием биологических тестирующих элементов с инертными белками; 3) адсорбцией тест-объектов на водонерастворимом носителе с последующей обработкой бифункциональным реагентом; 4) активацией носителей бифункциональными реагентами с последующей иммобилизацией тест-объекта.

Наиболее часто для этих целей используются глутаровый диальдегид (I), гексаметилендиизоцианат (II), адипинат (III), диазобензидин-3,3-дианизидин (IV), 4,4-диизотиоцианатдифенил-2,2-дисульфоновая кислота (V) и сим-трихлортриазин (хлористый цианур) (VI) (рис. 9).

В качестве примера рассмотрим вкратце процедуру адсорбции ферментов на водонерастворимом носителе с последующей обработкой бифункциональными реагентами, которая применяется для получения ферментативных мембран. Исходными материалами служат целлофан, коллаген и другие вещества, в качестве бифункциональных реагентов для фиксации адсорбированных ферментов используются глутаровый диальдегид (I), диазобензидин-3,3-дианизидин (IV) и др.

Используя целлофан, коллаген или эфиры на основе целлюлозы, можно получить весьма тонкие мембраны. Комбинация из нескольких тонких мембран дает полиферментную мембрану с невысокой активностью. С применением коллагена можно создать и высокоактивные мембраны, которые по своей механической прочности превосходят полученные путем сшивания ферментов с альбумином. Коллагеновая мембрана для набухания обрабатывается кислотой или щелочью, после чего пропитывается водным раствором фермента и высушивается; или фермент добавляется в водную суспензию коллагена, суспензия перемешивается и высушивается. Затем мембрана обрабатывается глутаровым диальдегидом, что значительно улучшает ее фермент-связующую способность. Полученная таким способом мембрана может быть применена для изготовления ферментного электрода. Ковалентная сшивка с носителями. Иммобилизованные этим способом биологические тестирующие элементы используются в аналитических миниреакторах, где необходимы высокая механическая прочность и стабильность биокатализаторов. Иммобилизация выполняется путем пришивания ферментов к носителям, содержащим реакционноспособные группы, а также к предварительно активированным носителям. Из основных реагентов и аминокислотных остатков наиболее часто модифицируются – NH₂ группа лизина, – СООН группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, гистидина, цистеина и тирозина. При этом необходимо помнить, что реагенты не должны реагировать с аминокислотными остатками, ответственными за функциональное действие белков. Предварительное предсказание места атаки реагентов в белковой глобуле чрезвычайно затруднительно, поэтому в большинстве случаев требуется индивидуальный выбор метода иммобилизации.

Носители, содержащие реакционноспособные группы, представляют собой в основном органические полимеры, получающиеся путем сополимеризации малеинового ангидрида с этиленом или акриловой кислотой. Они содержат реакционноспособные ангидридные группировки, которые легко реагируют со свободными аминогруппами ферментов:

 

R–CO

O + H₂N–E RCONHT + R’COOH.

R’–CO

В последнее время производятся гелеобразные активированные носители, которые применяются при создании ферментных электродов. Сополимеры акриламида и производных акриловой кислоты, сшитые бис-акриламидом, носят название «энзакрилов».

Для осуществления ковалентной сшивки применяются вспомогательные реагенты, например бромацил. Да и в целом процесс образования ковалентных связей далеко не всегда протекает в мягких условиях и характеризуется достаточно высокими энерго- и трудозатратами.

Иммобилизация микрокапсулированием. Особенностью иммобилизации ферментов микрокапсулированием является то, что водные растворы белков включают в полупроницаемые микрокапсулы размером от одного до нескольких сотен микрон. Микрокапсулирование проводится методом межфазных коацервации и поликонденсации.

При межфазной коацервации белки-реагенты (гомогенные или малоочищенные) растворяются в водной фазе инертного белка, который улучшает их свойства, обволакиваются микроскопической сферической ультратонкой мембраной. Микрокапсулы образуются при энергичном перемешивании ферментного раствора с органическим растворителем и последующим добавлением раствора нитрата целлюлозы, из которого формируются стенки микрокапсул. Диаметр их зависит от степени дисперсности эмульсии. Для изготовления микрокапсул диаметром менее 10 мкм необходимы специальные гомогенизаторы.

При межфазной поликонденсации стенки сферических микрокапсул образуются в реакциях соединений на разделе фаз. Мембраны микрокапсул, синтезируемые из найлона, обладают пониженной по сравнению с нитроцеллюлозными мембранами стабильностью. Многие ферменты, например каталаза, в этом процессе инактивируются.

Существует два основных методических приема формирования стенок микрокапсул. При так называемом капельном методе раствор себацоилхлорида в органическом растворителе наливают в чашку Петри, щелочной раствор фермента и 1,6-гексаметилендиамина добавляют маленькими каплями при помощи шприца, толщина иглы которого определяет диаметр микрокапсул.

Метод эмульсионной поликонденсации заключается в том, что к щелочному раствору фермента и диамина при энергичном перемешивании добавляют растворы детергента и затем себацоилхлорида и детергента. Формирование микрокапсул заканчивается в течение 3 мин. Размер их обусловливается интенсивностью эмульгирования водного раствора в органическом растворителе и концентрацией эмульгатора. Толщина оболочек зависит главным образом от концентрации диамина.

Стенки микрокапсул, полученных методом межфазной поликонденсации, имеют поры, средний радиус которых равен 1,8 нм. Для глюкозы коэффициент проницаемости стенок полиамидных микрокапсул равен 5,4×10^-7 м/с, коллодиевых микрокапсул – 7,3×10^-7 м/с. Таким образом, белки, у которых радиус молекулы больше 1,8 нм, не будут заметно выходить из микрокапсул, а низкомолекулярные субстраты и продукты ферментативных реакций легко проходят через стенки микрокапсул.

Разработаны и более усовершенствованные способы микрокапсулирования. Замена себацоилхлорида другими бифункциональными электрофильными реагентами приводит к синтезу стенок другой химической природы.

Предложен метод микрокапсулирования ферментов (уреазы) путем формирования стенок из детергента, высокомолекулярного амина и углеводорода с молекулярной массой 386. Получающиеся микрокапсулы обладают высокой механической прочностью и сохраняют хорошую каталитическую активность.

Включение ферментов в полые волокна также является одним из методов иммобилизации микрокапсулированием. При добавлении водного раствора фермента к раствору полимера в не смешивающемся с водой растворителе получается эмульсия, из которой формируются волокна. Ферменты захватываются в полые волокна благодаря пористой структуре последних.

Наконец, широкое распространение получил метод инкапсулирования ферментов в сферических микрочастицах, стенки которых формируются из фосфолипидов в так называемые липосомы. Липосомы обладают низкой механической прочностью и поэтому применяются в особых случаях – при использовании мембраносвязанных белков (например, ионных каналов).

До недавнего времени иммобилизованные в микрокапсулах ферменты не находили применения в аналитической химии. Это, по-видимому, обусловлено тем, что способ сравнительно сложен и требует хорошо отлаженной методики. В последнее время наметился некоторый прогресс в развитии этого метода. Дело в том, что использование коферментзависимых ферментов требует регенерации коферментов. Один из путей решения этой проблемы состоит в применении высокомолекулярных производных коферментов и полиферментных систем, включенных в микрокапсулы.

В заключение главы дадим сравнительную характеристику методов иммобилизации на примере пригодности их для создания биосенсоров на основе ферментов. Иммобилизованные ферменты, полученные путем адсорбции, включения в гели, сшивания бифункциональными реагентами и ковалентной сшивки, применяются в аналитических устройствах (табл. 4). Ферменты, полученные микрокапсулированием, широкого применения пока не нашли, что обусловлено главным образом сложностью их получения. В зависимости от того, основой какого аналитического устройства является иммобилизованный фермент, применяется тот или другой метод фиксации белков.

В системах на основе мини-реакторов необходимы прочно пришитые к носителю иммобилизованные тест-объекты, поэтому здесь целесообразна ковалентная сшивка. В устройствах, действие которых определяется диффузией растворов и веществ через слой иммобилизованного фермента (в электродах, подложках для флуоресцентных измерений), применяются ферменты, включенные в гели и сшитые с бифункциональными реагентами.

 

 

Таблица 4