Методы б/т в животноводстве: оплодотворение in vitro.

Этот метод открывает возможности получения большого числа эмбрионов у животных с большим генетическим потенциалом. На основе оплодотворения in vitro можно получит желаемое количество однояйцовых близнецов и повышать эффективность семени. Стадии оплодотворения:

1.Созреваниие ооцитов in vitro(только ооциты крупнорогатого скота)Получают из яичников после убоя, либо в течении жизни. созревают в течении суток на среде, имеющей сыворотку крови, антибиотики и гранулярные клетки

2.Капацитация сперматозоидов. Капацитация - это процесс физиологического изменений в сперме и приобретения способности к оплодотворению. Проводиться с помощью гипориноподобных веществ.

3.Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Основным критерием для установления оплодотворения является образование 1ого и 2ого порядка телец мужского и женского пронуклеусов. Ооцит помещают в каплю среды и вводят суспензию сперматозоидов в концентрации 1 к 1,5 миллионам. Через 44-48 часов определяют наличие дробления ооцитов. Эмбрионы помещают на моноклональный эпителий клеток на 5 дней. Первый теленок был получен таким методом в 1982 году

 

47. Методы б/т в животноводстве: клеточная инженерия.

Число потомков у 1 особи высших животных бывает небольшим, а комплекс генов,которые определяют высокую продуктивность возникает редко и может не сохраняться и изменяться. Ядро соматической клетки обладает полной генетической информацией о организме и гене. Созданием условий для ее реализации. То есть можно получить большое количество копий с 1 особи, т.как ядра соматических клеток находятся в дифференцировочном состоянии. Эту задачу можно решить с помощью эмбриональных клеток, когда еще не произошла их дифференциация. Существует несколько способов получения однояйцовых близнецов

1.Микрохирургическое разделение на ранних стадиях развития на 2 и более частей(дуплет эмбрионов).На более поздних стадиях развития уменьшается вероятность получения бластоцист до стадии рождения. Показано, чем продолжительнее этап культивирования, тем меньше жизнеспособность эмбрионов. Разделенные эмбрионы можно хранить в замороженном состоянии. Первый клон получен в США в 2001 г. На кошке.

2.Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер в энуклеированной яйцеклетке. Техника получения монозиготных близнецов имеет ряд ограничений: -клонирование не высоко продуктивного родителя его потомок, признаки которого еще точно неизвестны, -максимальное количество особей 3-4 от одного эмбриона, -последовательное разделение эмбрионов сопровождается формированием структуры бластоцист меньшего размера с меньшим количеством клеток. Стадии клонирования эмбрионов путем пересадки ядер в энуклиированную яйцеклетку:

1.выделение интактного ядра донора

2.энуклеация ооцита

3.пересадка ядра в энуклиированную яйцеклетку

4.активация ооцита и слияние мембран ядра яйца и ооцита под действием электрического тока.

Преимущества метода:

1.отдельные эмбриональные клетки полученные из эмбриона на стадии 64 клеток могут быть репрограмированы в одноклеточные зиготы и могут дать множественные копии генетически однородных животных

2.повторное клонирование путем пересадки от клонированных эмбрионов повышает потенциальные возможности технологий в производстве большого числа копий.

3.можно получить клон определенного пола.

4.эмбрионы полученные от различных генетических линий могут быть заморожены и разморожены после тестирования клона на продуктивность Использование эмбриональных стволовых клеток - перспективное направление,такие клетки способны к пролиферации в культуре и сохранят способность к дифференцировке в условиях in vitro и in vivo.

3.Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Несовместимость может быть преодолена с помощью микрохирургии путем получения химерных эмбрионов (овец, коров разных пород)

 

 

48.Технология рекомбинантных ДНК. Ферменты и способы конструирования.

Под рекомбинантными ДНК понимают, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.Ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены специфичности, экспериментатор может сочетать фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

1. с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

2. синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

3. ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

4. ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

1.Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями.Любые два фрагмента, образовавшиеся под действием одной рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей, но полной целостности двойной спирали не восстановится. Для его восстановления используют фермент ДНК-лигазу.

2.Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод).Тупые концы могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях.Эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу.

3.Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами.Для сшивки фрагментов некомплементарных друг другу липкие концы, применяют линкеры-химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию.Необходимо соблюдать правила экспрессии генетической информации.Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".Липкие концы можно превратить в тупые(эндонуклеаза S1).

 

49.техн рек ДНК.способ. получ ген. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование). 1. Из организма донора извлекают нужную ДНК, подвергают ее ферментативному гидролизу и извлекают нужный ген. 2. У бактерий или других клеточных структур извлекают вектор (плазмиду) и его разрезают. 3. Вставляют в вектор фрагмент ДНК. 4. Полученную конструкцию вводят в кл хозяина, где она передается потомкам. 5. Получают специфический белковый продукт, синтезируемый клетками хозяина.

Способы получения нужного гена. 1. Химический синтез. определяют последовательность нуклеотидов(НК) ДНК на участке гена и производят его синтез из НК при помощи фермента полимераза-1. в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина. В 1977 г. В. Гилбертом, а также Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот.

Метод химического синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью НК. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 НК.

2. Рестрикционный метод, или получение генов с помощью специфических эндонуклеаз – рестриктаз. Эти ферменты открыты в 1953 г. у бактерий. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина. К настоящему времени из разных м\орг выделено более тысячи разл. рестриктаз; в ген. инженерии используется около 200. Рестриктазы гидролизируют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. Из нескольких типов рестриктаз в генной инженерии часто используются рестриктазы двух типов, которые узнают определенную послед-ть ДНК и гидролизуют ее внутри послед-ти сайта рестрикции.

Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восст-ся. Фрагменты с «липкими» концами наиболее удобны для создания рекомбинантных ДНК. Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать хим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные послед-ти.

Недостатки метода:1) Достаточно трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, мешающие использованию гена. Рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной послед-сти гена, в результате ген теряет функциональную полноценность.2) Гены эукариот имеют сложное строение: включают экзоны и интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК. Наличие интронов является препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов.3) При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов. Выделить из нее фрагменты, несущие нужный ген – сложная задача.

3. Ферментативный синтез генов стал возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы (Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице. Ферментативный синтез генов на основе выделенной из кл м-РНК. Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК) используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы.+ данного метода является то, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того, легче создать условия, когда кл аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.

4. Химико-ферментативный синтез (ХФС) генов применяется наиболее часто. Хим путем синтезируют олигонуклеотиды: линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры (соединять) - короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз. Адаптеры - это линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами.

Праймеры - короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор (80-10 НК) - фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой.Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает хим синтез коротких одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между НК и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов. ХМС позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов. Методом ХФСполучены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

 

50. Под понятием "вектор". понимается молекула нуклеиновой к-ты, способная после введения в кл к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции. Векторные молекулы (ВМ) должны обладать следующими свойствами:

1) способностью автономно реплицироваться в кл-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном; 2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у кл-реципиента появляются новые призна­ки, позволяющие отличить трансформированные кл от исходных3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.

векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.

В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений.

Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из кл в кл, др такой способно­стью не обладают. Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров.

Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созда­ны на базе геномов бактериофагов E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, кот можно делегировать или за­менить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. Перенос чужеродных генов в кл животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы.

После трансформации, конъюгации необходимо идентифицировать кл, несущие ген-мишень. Отбор кл проводят в две стадии. 1): отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Например, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.

2): поиск кл, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов. 1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов: А)определение нуклеотидной последовательности ДНК: из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводится поиск участков, несущих этот ген; затем проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена; В)гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом, который может быть или интересующим геном, или соответствующей ему мРНК. Предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:А)- непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном;Б)использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень; В)иммунологическая детекция применяется, если искомый ген в составе рекомбинантной ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип организма.

50.Существует несколько типов векторов:

Бактериальные плазмиды очень маленькие кольцевые молекулы ДНК плазмид длиной несколько тысяч пар оснований.Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов кальция плазмиды легко поглощаются бактериями-рецепиентами, даже если те их никогда не содержали, и в клетках бактериального потомства можно обнаружить много копий поглощенной плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. она содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, Вирусы.Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся ДНК-вирусы SV-40 и вирус полиомы. Вирусы являются одними из главных кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования.

Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды.

Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу(обеспечивая проникновение гибридной ДНК в клетку путем инекции, после чего происходит замыкание ДНК в кольцо и репликация ее по плазмидному типу.

Фазмиды - гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могутразвиваться либо как фаг, либо как плазпид.

Вироиды - самые мелкие вирусы, способные к независимой репликации, имеют размеры генома(около 1500 тыс. пар оснований). Они реплицируются ферментами клетки-хозяина, не транслируются в видоспецифичные полипептиды, интегрируются в геном клетки-хозяина.Вироиды заражают персиситентно (не происходит выздоровления). Мигрируют из сайта внедрения в другие части растений, переносятся механически или через клеточный сок, через семена, пыльцу. Вироиды могут размножаться в ядрах.

Плазмиды агробактерий

В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium относящимся к роду Rhizobium. Особенность -один из партнеров специфически видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном.

Хлоропластная и митохондриальная ДНК Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой генетической информацией, так называемым пластомом. У высших растений он представляет собой замкнутую молекулу ДНК длиной 150 т. н. п., достаточную для кодирования примерно 100 белков. Для синтеза пластид необходимо значительно больше белков. Остальные белки кодируются ядром, синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты. Некоторые важнейшие белки хлоропластов состоят из нескольких субъединиц, часть из них синтезируется на рибосомах цитоплазмы и транспортируется в хлоропласт, где они объединяются с другими полипептидами, закодированными в самом хлоропласте и там же синтезируемыми. В отличие от хлоропластной, ДНК митохондрий характеризуются исключительным разнообразием и их величина колеблется от 200 до 2400 т. н. п.. В составе митохондриальной ДНК имеются структурные гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется ядерными генами.

Транспозо́н — последовательность ДНК, способная перемещаться внутри генома в результате процесса, называемого транспозицией. Транспозоны — один из классов мобильных элементов генома, которые, встраиваясь в геном, могут вызывать мутации, в том числе и такие значительные как хромосомные перестройки. Они играют важную роль в процессах переноса лекарственной устойчивости средимикроорганизмов, рекомбинации, и обмена генетическим материалом между различными видами как в природе (горизонтальный перенос генов), так и в ходе генно-инженерных исследований..

Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень.Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.
Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам.
Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:
а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:
– определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование;
– гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК;
б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном:

– непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;
– использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой;
– иммунологическая детекция, например, при поиске в бактериях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту.