Особенности культивирования клеток.

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы: Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH. Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассажирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассажировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, ее обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция. В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путем трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.

45. Методы б/т в животноводстве: трансплантация эмбрионов.

Позволяет решить задачу рационального использования животных производителей. Технология трансплантации эмбрионов включает следующие этапы:

1.Стимуляция суперовуляции, в организме имеется от 100-1000 половых клеток, но не все дают потомство, однако все фолликулы реагируют на гормоны и созревают, поэтому множественная обработка половых клеток ведет к суперовуляции.

2.Осемеляция донора:осуществляется через 4-5 суток,после первой инъекции гормонов. для повышения оплодотворения применяют лапароскоп.

3.Извлечение эмбрионов. Существует 2способа 1) хирургический (достоинство - можно сразу после овуляции). 2) нехирургический (с помощью котетора, не ранее 5 дня с момента осеменения). Хранят в питательной среде с антибиотиками и с добавлением эмбриональной сыворотки. Для коров могут использовать нехирургический, позволяет использовать донора 6-8 раз в год и извлекают 3-6 эмбрионов. для овец и свиней хирургический.

4.Хранение эмбрионов. В производственных условиях извлекают утром и пересаживают вечером, хранят в фосфатном буфере, при комнатной температуре, переносят снижение температуры до 0С (если вечером пересаживают). При необходимости длительного хранения эмбрионы замораживают при темп.-1960С и ниже (проходит многоступенчато, т.е постепенно охлаждают и помещают в жидкий азот) оттаивание проходит так же многоступенчато, медленно. Хранятся эмбрионы на стадии морулы и бластоцисты.

5. Пересадка эмбрионов. Существует так же 2 способа:

-хирургический и -нехирургический как в случае извлечения эмбрионов.