Аспартат- и аланин-аминотрансфераз в сыворотке крови.

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени (гепатитов). Аланинаминотрансфераза повышается весьма рано. При затяжном течении болезни наблюдается длительная гиперферментемия. При инфаркте миокарда в 95% случаях в сыворотке повышается активность аспартатаминотрансферазы. Изменения аминотрансфераз наблюдаются и при некоторых других заболеваниях.

В сыворотке здоровых людей содержание аспартатаминотрансферазы (АсАТ) колеблется в пределах 10-40 МЕ/л, а содержание аланинаминотрансферазы (АлАТ) - в пределах 7-40 МЕ/л.

Принцип метода

В результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуются соответственно щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты:

СООН СООН СООН СООН

ç ç ç ç

СН-NН₂ + С=О ® С=О + СН-NН₂

ç ç АсАт ç ç

СН₂ (СН₂)₂ СН₂ (СН₂)₂

ç ç ç ç

СООН СООН СООН СООН

аспартат a-кетоглутарат оксалоацетат глутамат

СООН СООН СООН СООН

ç ç ç ç

СН-NН₂ + С=О ® С=О + СН-NН₂

ç ç АлАт ç ç

СН₃ (СН₂)₂ СН₃ (СН₂)₂

ç ç

СООН СООН

аланин a-кетоглутарат пируват глутамат

 

В процессе другой ферментативной реакции (декарбоксилирования) ЩУК превращается в ПВК. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останав-ливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты и определяется с помощью фотоэлектроколориметра.

Ход работы

Определение АсАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора (29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г D,L-аспарагиновой кислоты в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4), добавляют 0,1 мл сыворотки и пробирку помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем прибавляют 0,5 мл динитрофенилгидразинового раствора (19,8 мг 2,4-динитро-фенилгидразина в 100 мл 1 н. раствора НС1) и пробу выдерживают 20 мин при комнатной температуре для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0,4 н NаОН, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.

Определение АлАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ (29,2 мг a-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г D,L-аланина в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4), затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат на 30 мин при 37° С. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.

Контрольная проба. В контрольную пробу вместо сыворотки крови берут 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности ферментовпроизводят по калибровочному графику, показывающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК с учетом времени инкубации.

Эталоны ответов на тесты

 

1.1. – Д

1.2. – В

2.1. – 1–Б,В,Д,Е; 2–А,Г; 3–Б,Д,Е

2.2. – 1-Д, 2-А, 3-Г, 4-В

3.1. – 1,3

3.2. – 1,2,3

4.1. – Е (- - -)

4.2. – С (+ - -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Дезаминирование аланина через переаминирование с последующим участием НАД-дегидрогеназы в дыхательной цепи будет сопровождаться синтезом трех молей АТФ на моль аминокислоты. Образовавшаяся пировиноградная кислота пройдет обычный путь окисления: окислительное декарбоксилирование с образованием ацетил-КоА и распадом ацетила в ЦТК. Подсчитайте энергетический эффект окисления пировиноградной кислоты и прибавьте 3 моля АТФ, синтезированных за счет энергии, высвободившейся при окислительном дезаминировании аланина. (18 АТФ).

Задача 2.

Принцип решения тот же, что и в задаче 1: дезаминирование глутаминовой кислоты осуществляется при участии НАД-дегидрогеназы, а образующаяся при этом α-кетоглутаровая кислота сгорает в ЦТК. Подсчитайте ее энергоотдачу и прибавьте 3 моля АТФ. Для подсчета энергоотдачи необходимо написать частные реакции ЦТК. (12 АТФ).