Работа 3. Термолабильность ферментов.

 

Ферменты при нагревании до 60-80^о утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа снижается. В термолабильности ферментов можно убедиться на примере действия ферментов слюны: амилазы и мальтозы.

Порядок выполнения работы

В чистую пробирку отливают небольшое количество разведенной слюны (2-3мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают. В 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1-ю пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 5 раз, во 2-ю – 10 капель прокипяченной слюны, в 3-ю – 10 капель воды (в качестве контроля). Все пробирки помещают в термостат или водяную баню при температуре 38^о на 10 минут. После этого проделывают качественные реакции на крахмал и реакцию Фелинга на продукты расщепления.

Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калие. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание. Полученные результаты занесите в таблицу:

№ п/п	Субстрат	Фермент	Темпе-ратура	Реакция на крахмал с йодом	Реакция Фелинга	Выводы

Сделайте вывод о термолабильности ферментов.

 

Работа 4. Влияние рН среды на активность

Амилазы слюны.

 

Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе оптимальная концентрация водородных ионов. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимум рН (см. таблицу). Активность ферментов уменьшается, если рН меняется в любую сторону от оптимального значения. Отклонение рН от оптимума влияет на степень ионизации групп в активном центре фермента и субстрата, может нарушить связь между белковой частью фермента и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментами.

Оптимальное значение рН для некоторых ферментов

Фермент	рН
Пепсин	1,5-2,5
Трипсин	8,0-9,0
Сахароза кишечная	6,2
Амилаза слюны	6,9-7,0
Липаза желудочного сока	6,0
Липаза панкреатическая	7,0-8,5
Каталаза	7,0

Порядок выполнения работ

В 7 предварительно пронумерованных пробирок наливают 0,2 М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 М раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице:

№ п/п	Кол-во 0,2 М р-ра Na2HPO4 , мл	Кол-во р-ра лимонной к-ты, мл	рН смеси	Кол-во 0,5% р-ра крахмала на 1% р-р NaCl	Кол-во разведенной слюны (1:100), мл	Окрашивание с йодом
1.	0,58	0,42	5,6	по 10 капель	по 10 капель
2.	0,63	0,37	6,0
3.	0,69	0,31	6,4
4.	0,77	0,23	6,8
5.	0,87	0,13	7,2
6.	0,94	0,06	7,6
7.	0,97	0,03	8,0

Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по10 капель 1% раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 50 раз. Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38^о на 5-10 минут (в зависимости от индивидуальных особенностей активности слюны). Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калие, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно. В зависимости от активности слюны ее можно разводить не в 50, а в 10 раз.

Сделайте вывод о влиянии рН среды на активность ферментов.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – в

1.2. – б

2.1. – 1-в, 2-а, 3-д, 4-б, 5-е, 6-г

2.2. – 1-г, 2-б,в,д; 3-г; 4-г; 5-б; 6-е; 7-б

3.1. – 4

3.2. – 2,4

4.1. – Д (- + -)

4.2. – Д (- + -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Согласно теории индуцированного соответствия (теории Кошленда), связываясь с активным центром, субстрат вызывает изменение пространственной формы молекулы фермента и переводит его в более устойчивую, стабильную конформацию при действии температуры.

Задача 2.

Наличие сильного положительного заряда, большое число свободных орбиталей (следовательно, способность связывать большое число лигандов), возможность выступать в роли как акцептора, так и донора электронов – все эти свойства переходных металлов обусловливают их участие в биокатализе в качестве кофакторов.