Работа 3. Выделение казеиногена из молока.

 

В молоке казеиноген содержится в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении достигается изоэлектрическая точка, и казеиноген выпадает в осадок в свободном виде. Избыток кислоты мешает осаждению, т.к. при pH ниже изоэлектрической точки (ИЭТ казеиногена pH 4,7) молекулы белка перезаряжаются и казеиноген вновь переходит в раствор.

Ход работы

Молоко (2 мл) разбавляют равным объемом дистиллированной воды и осаждают казеиноген добавлением 2 капель 10% раствора уксусной кислоты. Казеиноген выделяется в виде хлопьевидного осадка, который отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой (2-3 раза). Небольшие порции осадка снимают с фильтра стеклянной палочкой и употребляют для цветных реакций на белки.

Гидролиз казеина и открытие в гидролизате фосфорной кислоты:

100 мг порошка казеина растворяют в пробирке в 3 мл 10% раствора едкого натра или кали. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника, закрепляют ее на асбестовой сетке металлической лапкой и нагревают. Через час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, жидкости дают остыть и нейтрализуют ее концентрированной азотной кислотой (12-15 капель) до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белков (пептоны). После отстаивания жидкость фильтруют, с фильтратом проделывают молибденовую пробу на фосфорную кислоту (к 20 каплям молибденового реактива добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на голом огне). Выпадает небольшой кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония (лимонно-желтого цвета).

12(NH₄)₂·MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12MoO₃ + 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O

желтый кристаллический осадок

Работа 4. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП)

В сыворотке крови турбидиметрическим методом.

 

Содержание ЛПНП (b-липопротеинов) в крови колеблется в зависимости от возраста, пола и составляет в норме 3-4,5 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, сахарном диабете, гликогенозах, ксантоматозе и ожирении.

Принцип метода

Метод основан на способности ЛПНП образовывать с гепарином комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. По степени помутнения раствора судят о концентрации ЛПНП в сыворотке крови.

Ход работы

1. В пробирку вносят 2 мл раствора хлорида кальция и 0,2 мл сыворотки крови. Содержимое пробирки перемешивают.

2. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против раствора хлорида кальция при красном светофильтре (630нм) в кювете на 0,5 см.

3. Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,04 мл 1% раствора гепарина и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях.

4. Рассчитывают концентрацию ЛПНП (с, г/л) по стандартной формуле: С = (Е₂- Е₁) х 10, где 10 – эмпирический коэффициент

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – в

1.2. – б

2.1. – 1-б, 2-г, 3-в, 4-а

2.2. – 1-а, в; 2-е; 3-б; 4-г,д; 5-ж

3.1. – 1,3

3.2. – 1,3

4.1. – А (+ + +)

4.2.– С (+ - -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Метгемоглобинемия, спровоцированная приемом нитратов.

Задача 2.

Содержание урогликопротеидов в моче снижено. Наличие крови и белка в моче может указывать на воспалительный процесс в мочевыводящих путях или о мочекаменной болезни. Необходимо определить содержание мочевой кислоты в моче.

 

 

Занятие 6. Коллоквиум по модулю

«Строение и функции белков.

Цель занятия. Проверить и закрепить у студентов знания о структуре, свойствах, классификации, биологической роли простых и сложных белков, умение использовать свои теоретические знания при решении ситуационных задач, а также степень усвоения ими некоторых методов качественного ана­лиза белков.

Содержание занятия.

– выполнение заданий тестового контроля на персональных компьютерах;

– контроль усвоения темы модуля путем устного собеседования с преподавателем.

При опросе помимо знаний теории будет обращаться внимание на знание студентами: принципа методов работ, выполненных на практических занятиях, умение трактовать полученные результаты анализов.

Методические указания к самоподготовке

 

При подготовке к этому контрольному занятию, просмотрите методические указания к занятиям № 1-5. Повторите структуры α-аминокислот, умейте назвать по формуле и писать по названию пептиды; методы качест­венного и количественного исследования белков. Обратите особое внимание на умение написать химические формулы строения небелковых компонентов сложных белков и их биологической роли.

Контрольные вопросы по модулю

«Строение и функции аминокислот, пептидов и белков».

1. Общая характеристика белков. Элементный состав белков.

2. История изучения белков. Формирование представления о белках как о классе соединении и важнейшем компоненте организмов. Исследования Мульдера, Данилевского, Фишера и др.

3. Структура, свойства, классификация и общая характеристика аминокислот.

4. Типы связей, обнаруживаемые в белковой молекуле. Особенности пептидной связи. Пептиды, номенклатура пептидов.

5. Первичная структура белков. Зависимость биологических, свойств белков от первичной структуры. Видовая специфичность первичной структуры белков (инсулин разных животных). Методы его исследования.

6. Конформация пептидных цепей в белках (вторичная и третичная структуры). Слабые внутримолекулярные взаимодействия в пептидной цепи; дисульфидные связи. Зависимость биологических свойств белков от вторичной и третичной структуры.

7. Четвертичная структура белков. Зависимость биологической активности белков от четвертичной структуры; кооперативные изменения конформации протомеров (например, гемоглобин).

8. Биологические функции белков. Способность к специфическим взаимодействиям («узнавание») как основа биологических функций всех белков. Комплементарность структуры центра связывания белка структуре лиганда; зависимость связывания от концентрации лиганда.

9. Глобулярные и фибриллярные формы белков. Пространственные конфигурации (α-кератиновая, β-кератиновая) фибриллярных белков, их свойства.

10. Общая характеристика физико-химических свойств белков. Оптические свойства растворов белка.

11. Растворимость и осаждаемость белков. Факторы стабилизации белковой молекулы в растворах.

12. Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использование высаливания.

13. Денатурация белков. Факторы денатурации. Механизм денатурации. Практическое использование денатурации белков.

14. Электрические свойства белков. Механизм возникновения электрического заряда белков. Изоэлектрическая точка.

15. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге, протеинограмма здорового человека. Понятие об электрофорезе белков на полиакриламидном геле и разделении белков методом хроматографии.

16. Количественные методы определения белка. Определение белка крови биуретовым методом. Нормальное содержание белка крови. Гипопротеинемия, гиперпротсинемия. Белковый коэффициент крови.

17. Принципиальная схема устройства и работа фотоэлектроколориметра (ФЭК). Значение калибровочного графика.

18. Принцип метода диализа, его практическое значение.

19. Биологическая роль белков. Структурная, ферментативная, защитная, со-кратительная, транспортная, регуляторная, рецепторная функции белков.

20. Классификация белков. Простые белки: альбумины, глобулины, гистоны, протамины, глутелины, альбуминоиды; их биороль, особенности структуры и свойства.

21. Сложные белки. Общая характеристика отдельных групп сложных белков.

22. Нуклеопротеины. Понятие о нуклеиновых кислотах. Их классификация. Отличия ДНК от РНК. Виды нуклеиновых кислот.

23. Нуклеотид - структурная единица ДНК и РНК. Составные компоненты и номенклатура нуклеотидов. Химическая структура отдельных мононуклеотидов и нуклеозидов.

24. Понятие о первичной, вторичной и третичной структуре ДНК и РНК. Отечественные и зарубежные ученые, внесшие существенный вклад в расшифровку структуры ДНК. Правила Чаргаффа.

25. Характеристика особенностей строения транспортных РНК и их биологическая роль. Понятие о генетической РНК.

26. Гликопротеины. Определение. Классификация. Отличия гликопротеинов и протеогликанов. Характеристика простетической группы гликопротеинов. Классификация углеводов. Структура, химические свойства, биологическая роль простых углеводов.

27. Гликопротеины плазмы крови. Методы их исследования. Биологическая роль отдельных представителей (трансферин, гаптоглобин, церулоплазмин, транскортин, урогликопротеиды и др.).

28. Протеогликаны. Общая характеристика простетической группы протеогликанов. Классификация гликозаминогликалов (ГАГ). Кислые гликозаминогликаны, содержащие серную кислоту. Общий принцип их строения, отдельные представители (гепарин, хондроитинсульфат).

29. Хромопротеины, Общая характеристика железосодержащих хромопротеинов.

30. Cтpyктypa протопорфирина, порфирина, дыхательного фермента Варбурга, уропорфирина, копропорфирина, Содержание порфиринов в моче в норме. Понятие о порфирии и порфинурия.

31. Гемоглобин. Строение гема, α- и β-цепей глобина. Характер связей белковых мономеров и гема в гемоглобине.

32. Производные гемоглобина. Схема строения окси-, карб-, карбокси- и метгемоглобина. Условия образования гемоглобина. Помощь при отравлении угарным газом и метгемоглобинемии.

33. Формы гемоглобина (Нb А, Нb Р, Hb F, Hb S). Понятие о гемоглобинопатиях.

34. Качественная реакция на обнаружение гемоглобина (проба Тейхмана). Значение этой пробы.

35. Липопротеины. Общая их характеристика. Биологическая роль.

36. Липопротеины сыворотки крови. Строение. Методы разделения. Характе­ристики отдельных фракций. Аполипопротеины.

37. ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП, хиломикроны. Характеристика. Функция. Метод разделения.

38. Особенности строения и синтеза фосфопротеинов в клетке. Значение фосфорилирования-дефосфорилирования в процессе химической модификации макромолекул.

Модуль 2. Ферменты