Вертикально расположенные пластины

Для электрофореза белков обычно используют пластины
шириной 8 — 14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 —
28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, на-
пример при секвенировании, нередко ведут в больших пласти-
нах размером 33 ´ 43 см, что диктуется максимальным размером
рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гид-
ролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины
ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а за-
тем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя
пластинами зеркального стекла толщиной 5 — 6 мм. Расстояние
между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона
или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля.
Прокладки шириной 10 — 15 мм устанавливают вдоль боковых
краев стекол. Для аналитических целей, как правило, исполь-
зуют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от
0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уп-
лотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердев-
шего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно
такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю
стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боко-
вых прокладок.

Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-
фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-
сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки
из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро-
шо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а
также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые про-
кладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и
к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю про-
кладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу,
следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в по-
лость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную
прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по все-
му периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажи-
мают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
проще — заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопласты-
рем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать.
Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с про-
кладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания
не произойдет. Для надежности можно сначала залить неболь-
шой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а
потом залить остальной ее объем.

Описано применение в качестве прокладки П-образной по-
лоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать
ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка

 

не нуждается в смазке [Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо
нижней прокладки сделать в нижней части формы «пробку» из
ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боко-
выми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавлива-
ют в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирую-
щими добавками, так, чтобы заполнить нижнюю часть формы
на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок.
Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаива-
ют воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и
внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают.
Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над проб-
кой и промыть поверхность буфером геля. Фирма «Bio-Rad»
предлагает для заливки пластин геля простое устройство, по-
зволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми
прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой рези-
ны. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее
уплотнение осуществляют просто пластилином.

Собранную и уплотненную одним из описанных способов
форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор
мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ
толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-
вать — в горизонтальном положении пластин. Это значительно
упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее
по торцам пластин водостойкой липкой лентой.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно за-
тем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как бы-
ло показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препа-
раты фракционируют в параллельных друг другу «треках».
В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд
одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов»,
куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не
заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют
«гребенку» из тефлона или плексигласа такой же или чуть мень-
шей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные
зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой.
На боковом сечении можно видеть, что верхняя часть гребенки
немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как
гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно — до упора
выступа о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показа-
ны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю про-
кладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы
выступают наружу. За эти концы нижнюю прокладку и выни-
мают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже
показаны только три зажима (с правой стороны пластин).

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким рас-
четом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель за-
полнил промежутки междуее зубцами. Гребенку начинают

 

вставлять с некоторым переко-
сом, чтобы под ее зубцами не за-
держивались пузырьки воздуха.
Для этой цели торцы зубцов
предварительно смачивают, по-
терев их о стекло с налитым на
него раствором акриламида.
В тех случаях, когда готовят
двухслойный гель, по окончании
полимеризации нижнего геля во-
ду отсасывают, поверхности про-
мывают буфером верхнего геля,
заливают этот последний и уже
в него устанавливают гребенку.

Рис. 7. Форма для полимеризации вертикальной пластины геля 1 — стеклянные пластины; 2 — прокладки; 3  — гребенка; 4 —  зажим

Когда гель готов, вынимают
нижнюю прокладку или снимают
липкую ленту и осторожно вы-
таскивают гребенку. При работе
с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам
гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться не-
ровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос
в геле.

В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля
пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На
границе между двумя слоями разной пористости полоса ис-
ходного препарата будет выгодным образом сужаться.

Перегородки между близко расположенными карманами в
агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Опи-
сан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из
плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее
верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пла-
стинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но
не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ши-
рине интервалов между перегородками, так что форма оказыва-
ется уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув фор-
му, заливают агарозу с противоположной стороны. После за-
стывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов
оказываются разделенными перегородками из плексигласа, кон-
цы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].

Для получения пластин с градиентом пористости геля по вы-
соте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной
пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную
трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом слу-
чае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь
мономеров малой концентрации, а резервуар — более концент-
рированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить гра-
диента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-
зующемся геле.

 

Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых
снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят
в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка
трубок. Фирма «Pharmacia» (Швеция) предлагает для этой це-
ли специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых
набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по
двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акрила-
мида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через
отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установле-
на только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида
и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого
сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из
плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в ла-
боратории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не гра-
диентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-
ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый
мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку
и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации
мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обре-
зают [Kerckaert, 1978].

Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках
можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров
разной концентрации путем многократного переворачивания
пластины или трубок в наклонном положении.

В литературе описано много конструкций приборов для
электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предла-
гают различные фирмы. Наибольшее распространение получила
конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером
(рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных
условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямо-
угольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой
имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой
же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между кото-
рыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными
зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпа-
ли. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, что-
бы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вто-
рая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли пе-
редней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов,
между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осущест-
влено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера.
Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма
«Bio-Rad» в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструк-
цию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой про-
кладки.

В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой
проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично по-
гружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается
там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец

 

Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах
(фирмы. «Pharmacia»)

Рис. 9. Прибор Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Stu-
dier, 1973]

 

оказывается приподнятым над дном резервуара. После погру-
жения надо внимательно проверить, не осталось ли между пла-
стинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить
струёй жидкости из согнутой иглы шприца.

Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином
вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора
так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный
буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять пре-
паратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на пол-
ную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.

Недавно был предложен очень простой, целиком (включая
пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для
вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-
се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по
всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон элект-
родным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно пере-
мешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне
прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла,
теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации
этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно сла-
бого сцепления ПААГ с плексигласом.

Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ
установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют
снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара.
Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок
прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют
за счет трения в прорезях прокладок («Bio-Rad», «Pharmacia»)
либо прижимают к ним шлифованными торцами («Desaga»).
В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, по-
этому приходится ограничиваться использованием фирменных
пластин и гелей определенной толщины.

Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-
верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в при-
бор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и
насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов.
Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказы-
вается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до
некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта
температура оказывается практически одинаковой по всемуего
сечению. Именно это обстоятельство является решающим для
обеспечения хорошего качества разделения.

В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке
и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь
между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем
же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-
ers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и
отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах.
Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во всех случаях
аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста-

 

ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом не-
сколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического
сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего
через гель (см. ниже).

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаи-
вая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают
между пластинами со стороны карманов и слегка поворачива-
ют. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала прой-
ти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, на-
блюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно прони-
кает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пла-
стины гель снимают руками и переносят в ванночку для фикса-
ции или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с
пластины за «нерабочий» конец, лучше все же работать в пер-
чатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверх-
ности геля при современных чувствительных методах окрашива-
ния может оставить на геле артефактное белковое пятно. При
авторадиографии влажный гель, лежащий на одной пластине,
можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.