Тема 3. 8. Механизмы, обеспечивающие разнообразие белков у эукариотов

У эукариотов набор и количество синтезирующихся белков может зависеть от доступности генов для транскрипции, перестройки генов, альтернативного сплайсинга и изменения стабильности мРНК.

1. В организме человека имеется более 200 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям, хотя количество и структура ДНК в них практически одинаковы. Существование специализированных органов и тканей зависит от экспрессии генов, при которой в дифференцированных клетках разных тканей транскрибируются разные участки хроматина. Это достигается благодаря существованию механизма стойкой репрессии транскрипции части генов на протяжении всей жизни организма. В разных тканях стабильной репрессии подвергаются разные

гены. Формирование зон стабильной репрессии происходит в процессе онтогенеза и дифференцировки клеток.

Транскрипционно неактивные или стабильно репрессированные участки хроматина получили название гетерохроматина. Стойкая репрессия генов в участках гетерохроматина обеспечивается:

• высококонденсированным состоянием ДНК;

• метилированием дезоксицитидина в CpG-последовательностях ДНК (эта модификация изменяет конформацию хроматина и препятствует транскрипции);

• связыванием ДНК с гистонами и образованием нуклеосом.

В хроматине клеток разных органов и тканей наряду с нетранскрибируемыми зонами ДНК имеются активные или потенциально активные участки - участки эухроматина. В областях эухроматина на ДНК расположены транскрибируемые гены. Эти области характеризуются:

• наличием молекул гистонов, в которых метилированы или ацетилированы аминогруппы в радикалах Лиз и Арг, а остаток Сер фосфорилирован. Это снижает суммарный положительный заряд гистонов и ослабляет их связь с ДНК в нуклеосомах;

• наличием участков, более чувствительных к действию ДНКаз.

За исключением лимфоцитов каждая клетка организма содержит один и тот же набор генов. Однако «активность» одних и тех же генов в клетках тканей может существенно различаться. Например, в ретикулоцитах участок ДНК, содержащий ген β-глобина, находится в области «активного» хроматина, а в мышечных клетках локализован в районе «неактивного» хроматина.

2. Перестройка генов. Это явление наиболее отчетливо наблюдается при формировании разнообразия иммуноглобулинов (Ig). В зародышевых и всех соматических клетках нет полных генов, кодирующих L- и H-цепи Ig. Информация об отдельных участках цепи Ig представлена в виде соответствующих фрагментов молекулы ДНК- сегментов. В молекулах ДНК сегменты, кодирующие вариабельные (V) и константные (C) домены L- и Н-цепей (легких и тяжелых цепей соответственно), разделены протяженными нуклеотидными последовательностями. Обнаружено три разных семейства сегментов. Это два семейства, ответственные за синтез легких цепей, - λ (локализованное в 22-й хромосоме) и κ (2-я хромосома) - и одно семейство, содержащее информацию о всем разнообразии Н-цепей (14-я хромосома). Каждая легкая цепь кодируется тремя отдельными сегментами: V (вариабельным), J (соединяющим) и С (константным). Для κ-цепей существует по 250 V-сегментов, 5 J-сегментов и 1 С-сегмент (рис. 3.24). Тяжелые цепи кодируются 4 сегментами ДНК: V_H, D (сегмент разнообразия), J_H и C_H. У человека около 1000 Vjj-сегментов, более 12 D-сегментов и 4 Jjj-сегмента.

В ходе дифференцировки клеток - предшественников В-лимфоцитов полные гены L-цепей собираются из трех сегментов в результате одной соматической рекомбинации: один из 250-ти V_L сегментов соединяется с одним из 5 J-сегментов с образованием смешанного VJ-экзона,

Рис. 3.24. Синтез легкой κ-цепи иммуноглобулина

Рекомбинация объединяет один V-сегмент вариабельного домена с одним из J-сегментов и приближает их к константному сегменту (C). После транскрипции образуется первичный транскрипт (пре-мРНК). Удаление лишних J-сегментов и интронов происходит в ходе посттранскрипционной модификации этой пре-мРНК, что приводит к появлению зрелой мРНК, после трансляции которой появляется белковый вариант легкой цепи Ig. Молекула ДНК показана в виде одной цепи

а нуклеотидная последовательность ДНК между выбранными сегментами удаляется. С помощью такой перегруппировки V_L- и JL-сегменты, выбранные из множества им подобных, транскрибируются с образованием единой молекулы мРНК предшественника. После созревания она превращается в мРНК, кодирующую одну из L-цепей Ig. Сходным образом образуются легкие λ-цепи.

При формировании полного гена Н-цепи первоначально собирается смешанный экзон из двух любых D- и J-сегментов в процессе первой рекомбинации. Затем в ходе второй рекомбинации к DJ-экзону присоединяется один из VH-сегментов и образуется полный ген Н-цепи IgM, поскольку к смешанному VHDHJH-экзону, кодирующему вариабельный домен Н-цепи, ближе всего находится СH-сегмент. Десять С_Н-сегментов константной

области: Сμ Сδ, С_у3, С_у1, С_а1, С_у2, С_у4, С_е и др. - содержат информацию о строении доменов этой области и определяют классы и подклассы иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA и т.д. Соединяя различные кодирующие V-, D-, J- и C-сегменты, организм может синтезировать миллионы разных молекул Ig.

Иммуноглобулины (Ig) являются гликопротеинами, поэтому одной из посттрансляционных модификаций, которым подвергаются Н-цепи Ig, является синтез олигосахарида в С-области молекулы.

Первыми в иммунном ответе появляются IgM, поскольку ген, кодирующий Сμсегмент Н-цепи, расположен на 5'-конце кодирующей области ДНК впереди всех остальных С-сегментов. Переключение классов Ig сопряжено с дополнительной специфической рекомбинацией, в процессе которой удаляются С-сегменты между полным геном вариабельной части и С-областью синтезируемого класса Ig. Таким образом, перестройка генетического материала в процессе формирования полных генов Ig проходит в несколько последовательных этапов, и каждый из них приурочен к строго определенной стадии дифференцировки В-лимфоцитов. Аналогичные процессы наблюдаются и в ходе дифференцировки Т-лимфоцитов.

3. Альтернативный сплайсинг мРНК. В ядре синтезируется значительно больший набор первичных транскриптов, чем количество зрелых мРНК в цитоплазме. Контрольные механизмы клетки определяют, какие из пре-мРНК подлежат процессингу, а какие будут расщепляться до нуклеотидов. Ранее уже говорилось о том, что созревание мРНК включает несколько этапов:

-кэпирование 5'-конца;

- присоединение поли-(А)-фрагмента к 3'-концу;

- сплайсинг (удаление интронов).

В некоторых случаях наблюдается альтернативный сплайсинг в сочетании с полиаденилированием, что приводит к образованию нескольких «зрелых» мРНК, кодирующих различающиеся между собой белки из одного и того же первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы в ходе транскрипции гена кальцитонина образуется мРНК, которая содержит информацию о гормоне белковой природы, ответственном за регуляцию обмена ионов кальция (рис. 3.25). В мозге тот же первичный транскрипт подвергается другому варианту сплайсинга и полиаденилирования, и получается мРНК, кодирующая белок, ответственный за вкусовое восприятие.

Рис. 3.25. Сплайсинг пре-мРНК гена кальцитонина в клетках щитовидной железы и мозга

Альтернативный сплайсинг описан для большого числа транскрибируемых генов. В частности, он показан для генов, кодирующих Ig. На ранних стадиях развития пре-В-лимфоциты продуцируют IgM, которые связаны с клеточной мембраной. Они синтезируются на мРНК, содержащей экзон, в котором имеется информация о гидрофобном участке С-области Ig. С помощью этого участка происходит «заякоревание» IgM в мембране (рис. 3.26).

Рис. 3.26. Образование матриц для синтеза мембранно-связанных (1) и секреторных (2) форм Ig.

Участок ДНК Сμсегмента (показана одна цепь ДНК) включает экзоны и содержит два стоп-кодона: один - в области интрона между двумя экзонами, второй - в составе второго экзона. В процессе транскрипции этого участка ДНК образуются два варианта первичного транскрипта как результат прочтения разных стоп-кодонов. После трансляции транскриптов образуются две разные формы IgM: «заякоренной» (1) в мембране и секреторной (2)

В ходе дифференцировки образуются плазматические клетки, в которых за счет остановки транскрипции на стоп-кодоне 1, входящем в интрон, и альтернативного полиаденилирования исчезает экзон, кодирующий гидрофобный участок молекулы, и синтезируются укороченные молекулы антител, которые секретируются в кровь.