Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного

определения нуклеиновых кислот

 

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор; дифениламиновый реактив^*; орциновый реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал.

1. Гидролизат ДНК ткани селезенки (см. работу 13, г).

2. ДНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

3. РНК дрожжевая, опытный раствор.

4. РНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

 

а. Определение содержания ДНК (по Дише). Метод основан на образовании окрашенного комплекса дезоксирибозы с дифениламином (см. работу 13, б), интенсивность которого пропорциональна концентрации этой пентозы в гидролизатах ДНК.

Ход определения. В пробирку наливают 0,5 мл стандартного раствора ДНК и равный объем раствора хлорной кислоты. Ставят пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают содержимое.

Во вторую пробирку вносят 1 мл гидролизата ДНК ткани селезенки (опытная проба), затем прибавляют в обе пробирки по 2 мл дифениламинового реактива Дише. Пробы перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 10 мин для развития окраски. Затем содержимое пробирок охлаждают.

Опытную и стандартные пробы фотометрируют против контрольной пробы на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 595 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольную пробу готовят перед фотометрией. Она содержит 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл раствора хлорной кислоты, 2 мл реактива Дише. Кипятят содержимое пробирки в течение 10 мин на водяной бане. Охлаждают.

Расчет. Содержание ДНК в опытной пробе х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = ————,

Е_ст ,

 

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать концентрацию опытного образца ДНК, указать в выводе возможность использования дифениламиновой реакции для количественного определения ДНК.

б. Определение содержания РНК. Метод основан на образовании окрашенного комплекса рибозы, входящей в состав РНК, с орцином. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации РНК в растворе.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 2 мл соответственно исследуемого (опытного) и стандартного растворов РНК, приливают по 2 мл орцинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. Пробы охлаждают.

Фотометрию опытной и стандартной проб проводят против контрольной на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольная проба обрабатывается так же, только вместо раствора РНК используется такое же количество дистиллированной воды.

Расчет. Концентрацию РНК в опытном образце х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = ——————,

Е_ст

 

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкциям рассчитать концентрацию опытного образца РНК, указать в выводе возможность количественного определения РНК по орциновой реакции на пентозы.

 

 

ЛИПИДЫ

 

Липиды – разнородная по химическому строению группа органических веществ биологического происхождения, практически нерастворимых в воде и легко растворимых в органических неполярных (хлороформ, эфир, бензол, дихлорэтан и др.) и полярных (этанол, метанол, ацетон и др.) жидкостях. Разнообразие химического строения липидов затрудняет их классификацию. Эту группу веществ можно разделить на липидные мономеры (жирные кислоты, высшие алифатические и аминоспирты и др.), простые липиды (ацилглицерины, воска, диольные липиды), сложные липиды (фосфолипиды и гликолипиды) и стероиды (наиболее распространенный из них – холестерин и его эфиры). Биологические функции липидов в живых организмах многообразны. Они содержатся в жидких средах и входят в состав биологических мембран клеток организма. Ввиду плохой растворимости в воде липиды образуют соединения с гидрофильными молекулами – белками, углеводами. Образование липид-белковых комплексов (липопротеидов) придает липидам растворимость в воде и позволяет транспортироваться с кровью и лимфой в организме. Своеобразие растворимости используется при исследовании липидов, поскольку позволяет отделить их от других веществ, которые находятся в биологическом материале. Поэтому подбор растворителей в ходе извлечения липидов из образцов имеет большое значение при их анализе.

Для обнаружения и количественного определения отдельных представителей липидов, экстрагированных из биологического материала, существуют различные физико-химические методы и реакции на функциональные группы. Анализ липидов проводят путем постановки специфических реакций на составные части в целой молекуле или после ее гидролиза.